espectofotometria informe


Concentración y determinación de proteínas por espectrofotometría

RESUMEN
Palabras Clave:
INTRODUCCIÓN
La espectrofotometría es una técnica empleada para determinar sustancias en el análisis espectrofotométrico el cual se basa en el el hecho de que al pasar un haz de luz blanca a través de una solución coloreada, el complejo responsable absorbe ciertas longitudes de onda de maneraselectiva. El haz de luz blanca se hace paso a través de un monocromador (prisma) para seleccionar una longitud de onda específica, esta incide sobre la muestra y cuando sale se puede medircual es el porcentaje de absorción de luz que realizo la muestra
Utilizando la ley de Beer decimos que la absorbancia es proporcional a la concentración de la especie absorbente, y con la ley de Lambert decimos quela absorbancia es adimensional. Para determinar la concentración de proteínas se usa el reactivo de Biuret, el cual forma un complejo entre el ion cúprico y los enlaces peptídicos, con aparición de una coloración violeta – purpura que presenta una absorbancia de 540 nm.
Cumpliendo las leyes de Beer – Lambert y la longitud de onda se conserva constante, al graficar A (absorbancia) en función de C(concentración) se obtiene una recta que pasa por el origen. El método de curva de calibracion es usado para medir la concentración de una sustancia en un muestra por comparación con una serie de elementos de concentración conocida, con la absorbancia a la longitud de onda maxima.
Una de las características del reactivo de Biuret es que requiere una alta concentración de proteínas para laformación de color. La Albumina Serica Bovina (BSA) es una proteína extraida del suero bovino y la cual es muy empleada como nutriente en cultivos celulares, estabilizador de algunas enzimas durante la digestión de ADN, para evitar la adhesión de la enzima a los tubos de reaccion y para determinar la cantidad de otras proteínas mediante comparación. (1)


MATERIALES Y MÉTODOS.
PREPARACION INICIAL DELA LECHE
En un vaso precipitado de 250 mL se adicionó 50 mL de leche de vaca y 50 mL de agua destilada y se agregó, gota a gota HCl al 10% hasta que se obtuvo un pH ≤4.4, se dejo reposar durante 10 minutos y se filtró sobre varias capas de muselina. Este proceso se hace también con leche de cabra.
CUANTIFICACION DEL FILTRADO
En un tubo de ensayo se adicionó 10 mL del filtrado transparente y sele agregó NaOH al 10 % hasta llegar a un pH ≈ 8. Este es el extracto de proteínas usado en los tubos D y D1. Se tomó 8 tubos de ensayos y se marcaron del 1 la 6, los tres restantes se marcaron como B, D Y D1. En el tubo B se adicionó 2 mL de agua destilada y 4 mL de reactivo de Biuret, en el tubo 1 se adicionó 0.2 mL de BSA, 1.8 mL de agua destilada y 4 mL de Biuret, en el tubo 2 se adicionó 0.4mL de BSA, 1.6 mL de agua destilada y 4 mL de Biuret, en el tubo 3 se adicionó 0.8 mL de BSA, 1.2 mL de agua destilada y 4 mL de Biuret, en el tubo 4 se adicionó 1.2 mL de BSA, 0.8 mL de agua destilada y 4 mL de Biuret, en el tubo 5 se adicionó 1.6 mL de BSA, 0.4 mL de agua destilada y 4 mL de Biuret, en el tubo 6 se adicionó 2 mL de BSA y 4 mL de Biuret, en el tubo D se adicionó 0.5 mL delextracto preparado previamente con leche de vaca, 1 mL de agua destilada y 4 mL de Biuret y en el tubo D1 se adicionó 2 mL del extracto preparado previamente con leche de vaca y 4 mL de Biuret. los tubos D y D1 se volvieron a repetir con el extracto preparada previamente con leche de cabra.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
CUANTIFICACION DEL FILTRADO
Tabla 1. Coloración del analíto para prueba deespectrofotometría

MUESTRA
OBSERVACIONES
Tubo B
Azul claro
Tubo 1
Azul claro
Tubo 2
Azul con un poco de purpura
Tubo 3
Azul – purpura
Tubo 4
Violeta
Tubo 5
Morado claro
Tubo 6
Morado
Tubo D (leche de vaca)
Azul claro
Tubo D1 (leche de vaca)
Morado claro
Tubo D (leche de cabra)
Azul claro
Tubo D1 (leche de cabra)
Morado claro

Una de las características principales al emplear el...