Espectro De Absorción De Aminoácidos Aromáticos

Instituto De Química
Bioquímica
Introducción a la espectroscopia Molecular


Espectro de Absorción de Aminoácidos Aromáticos
Laboratorio
Nombres:
Excequel Ponce G.
Daniela Urrutia J.



Objetivos:
* Registrar los espectros de absorción de los aminoácidos aromáticos midiendo la posición y la intensidad de sus bandas en función del pH.

* Demostrar la aditividad de losrespectivos coeficientes de extinción de los aminoácidos comparándola con el de una proteína de composición conocida.

Introducción:

La espectroscopia ultravioleta-visible involucra la absorción de radiación ultravioleta y visible, por una molécula, causando la promoción de un electrón de un estado basal a un estado excitado.
Para que ocurra una redistribución electrónica, el rango de laradiación debe estar entre 190 y 800 nm (Longitud de Onda), que corresponde a la absorción en UV-Visible, ya que así pueden observarse las distintas transiciones electrónicas de una molécula
En la experiencia, el intervalo de λ en el espectro, es de 240 – 340 nm, que corresponde a transiciones electrónicas de tipo nπ * y ππ *.
Los parámetros de medición implicados en la experiencia son:
Absorbancia:corresponde a la intensidad absorbida por la muestra con respecto a la emitida. Depende de la concentración molar y de la longitud de onda
Coeficiente de extinción molar (ε): Es una constante relacionada con la probabilidad de que ocurra una transición electrónica en una molécula y depende del estado energético de la misma y de la longitud de onda.
La espectroscopia UV-visible nos ayuda aidentificar transiciones electrónicas en la molécula, es independiente de la sustancia, lo importante es el rango de λ en el cual se trabaje, y dependiendo de la estructura electrónica que posea la molécula, implicará la obtención de un espectro. Lo anterior correspondería a una ventaja de esta técnica, ya que solo ciertas moléculas absorberán en un intervalo, por lo que es específica, permitiendo laidentificación de transiciones electrónicas en una muestra problema.
En la práctica, mediante la obtención de los espectros de absorción de los aminoácidos aromáticos: Fenilalanina, Tirosina y Triptófano, comprobaremos la presencia de éstos en la proteína Albúmina de suero bovino, ya que la estructura molecular de los aminoácidos presentes en la proteína, permiten transiciones electrónicas conel rango trabajado en la práctica lo cual se analiza en el espectro según los parámetros anteriormente nombrados.

Parte Experimental:
* Se realizan los espectros correspondientes, individualmente, de los tres aminoácidos, luego se comparan con el espectro de la BSA.
* Para esto se preparan las soluciones que contienen cada aminoácido individualmente, Triptófano, Fenilalanina, y tirosinaen tampón fosfato pH 7,4. Luego, registrar el espectro.
* Disolver tirosina en una solución 0.1 M de NaOH, y registrar el espectro.
* Preparar una solución de BSA, en tampón fosfato 0.1 M pH 7,4, con una concentración de 1,45E-3. Registre el espectro de absorción y medir el coeficiente de extinción molar a 280 nm.
* Colocar en una cubeta de espectrofotometría con el solvente eintroducirlo al espectrofotómetro para calibrar el instrumento, luego, sacarlo y poner otra cubeta con la muestra a analizar.
* Preparar las soluciones de acuerdo a la siguiente tabla:

Nº Solución | Aminoácido | gr/mL | Solvente |
1 | Trp | 3.0x10-5 | Tampón fosfato 0.1 M, pH 7.4 |
2 | Fen | 6.6x10-4 | Tampón fosfato 0.1 M, pH 7.4 |
3 | Tir | 1.05x10-4 | Tampón fosfato 0.1 M, pH 7.4 |
4| Tir | 6.6x10-5 | NaOH 0.1 M |

Datos
COMPOSICIÓN DE AMINOÁCIDOS AROMÁTICOS DE LA BSA

Aminoácido | Nº de residuos | Peso molecular gr/mol (gr/mol |
Triptófano | 2 | 204,23 |
Tirosina | 18 | 181,19 |
Fenilalanina | 24 | 165,19 |

Espectros:

Figura 1:
Espectro de absorción del triptófano, tirosina y Fenilalanina en solución tampón fosfato pH 7,4, que indica absorbancia...