Espectro De Luz

EXPERIMENTO 6

ESPECTRO DE ABSORCION DEL CITOCROMO-C OXIDADO Y REDUCIDO Y DETERMINACION CUANTITATIVA DE GLUCOSA
REQUISITOS Revisar los conceptos de espectrofotometría y fotocolorimetría.

OBJETIVOS Extraer y purificar parcialmente el citocromo-c, para comprobar su actividad por métodos colorimétricos ilustrando una reacción enzimática que usa ATP y su inhibición por iones

1.FUNDAMENTOS

Muchos métodos de análisis cuantitativo de materiales biológicos se basan en la separación de la sustancia en cuestión (presente en tales materiales) y su conversión química a una molécula capaz de absorber energía radiante. Si el producto en solución absorbe luz en la región visible del espectro, la solución será coloreada. La intensidad del color se usa como una medida de la concentracióndel producto disuelto y permite calcular la concentración de sustancia presente en el material biológico original. Por lo tanto revisaremos brevemente los principios involucrados para realizar estos tipos de análisis. 1.1. Aspectos teóricos

Un procedimiento colorimétrico se basa en la comparación de una solución coloreada (representando una concentración desconocida de la sustancia bajoanálisis) con un color patrón (que representa la sustancia de concentración conocida). La sustancia debe ser coloreada o ser capaz de dar reacciones que permitan la producción de color. Además, la intensidad del color debe depender de su concentración, de otra manera no tiene utilidad para propósitos colorimétricos. Un procedimiento fotométrico se basa en la medida directa de la intensidad del color entérminos de absorción de luz de la solución a una λ específica del espectro. A diferencia de los procedimientos colorimétricos los cuales 77

están limitados a la porción visible del espectro, los principios generales de fotometría se aplican tanto a la absorción de energía radiante en las regiones ultravioleta e infrarrojo del espectro como a la absorción de luz en la región visible. 1.1.1Colorimetría: Un procedimiento colorimétrico involucra tres operaciones fundamentales: 1. Preparación de la solución coloreada del compuesto desconocido. 2. Obtención de un patrón coloreado apropiado. 3. Comparación de los colores de 1 y 2. Esta comparación de colores se hace utilizando colorímetros (instrumentos que facilitan tal comparación). Esta comparación puede hacerse de varias maneras: 1.Porcomparación con una serie de patrones, 2. Por dilución al color exacto, 3.Por variación de la profundidad de la solución a través de la cual pasa la luz. 1.1.2 Fotometría: Consiste en la medida del poder transmisor de luz de una solución para determinar la concentración de material absorbente de luz presente en dicha solución. La proporción de luz incidente absorbida por la solución es función de laconcentración de tal sustancia. La capacidad de una solución para transmitir la luz es su transmitacia (T) la cual se define como la relación de la intensidad I2 de la luz emergente de la celda (que contiene la solución X) a la intensidad I1 de la luz incidente (que entra a la solución). T = I2/I1 En fotometría no es práctico ni necesario medir I1 o definir T de esta manera. En un procedimientofotométrico hay siempre una cierta proporción de pérdida inespecífica de luz durante su paso a través de la solución, debido a reflexión en las paredes de la celda, dispersión y absorción por el solvente, reactivos, etc. En consecuencia, se debe tomar en cuenta la reducción de la intensidad de la luz debido a factores diversos así como también la debida absorción por la sustancia cuya concentraciónse desea determinar. Esto se logra determinando la transmitancia relativa, en la cual la transmitancia de la solución conteniendo material absorbente de luz (T soln), y la transmitancia de la solución de referencia sin el material absorbente en cuestión (T solv) se comparan en iguales condiciones de λ intensidad de luz incidentes y profundidad de la solución a ser atravesada por la luz. 78...