Espectrofotometria
Páginas: 8 (1855 palabras)
Publicado: 7 de septiembre de 2011
ESPECTROFOTOMETRÍA
Introducción
La espectrofotometría es una de las técnicas más habituales y versátiles en el campo de la investigación biológica, ya que permite determinar, no sólo cualitativa y cuantitativamente muchos compuestos, sino seguir la cinética de reacciones enzimáticas, claves en los diversos procesos de interés biológico.
Fundamentos teóricos
Según la teoría ondulatoriade Maxwell, la luz ordinaria se presenta como una vibración electromagnética que viaja en línea recta a una velocidad uniforme, 3 x 108 ms-1 en el vacío, siendo la dirección de vibración de la onda perpendicular a la dirección de su propagación.
Una ecuación muy simple relaciona esa velocidad, c, con las otras características ondulatorias, como son:
( = longitud de onda
( = frecuencia delas mismas
c = (() (()
Así mismo, desde principios de siglo, y con la aparición de la teoría cuántica, a la luz se la considera también como una corriente de paquetes discretos de energía que denominamos fotones. La cantidad de energía asociada a cada fotón depende de la frecuencia de la luz, de acuerdo con la ley de Planck:
E = (h)(() y, por tanto, según lo anterior
E = (h) (c) / ( siendoh la constante de Planck = 6,626 x 10-34 J. s
La luz blanca engloba distintos componentes, cada uno de ellos con una longitud de onda (color) diferente, como pone de manifiesto su dispersión a través de un prisma. Una radiación electromagnética monocromática, contiene exclusivamente una sola longitud de onda (() determinada. Es con estas radiaciones monocromáticas con las que se trabaja enespectrofotometría.
Espectroscopía ultravioleta-visible (UV-V)
Los electrones en una molécula, al igual que en los átomos, tienden a ocupar los niveles más bajos de energía potencial, es lo que se llama estado fundamental.
La interacción de átomos y moléculas con radiaciones de diferentes longitudes de onda se plasma en: estados excitados que darán lugar a los espectros de absorción, cuandolas moléculas absorben cuantos discretos de energía de diferentes (, y a los espectros de emisión, cuando emiten dichos cuantos.
La espectroscopía UV-V, como la IR (infrarroja), es una técnica que mide la absorción, registrando por tanto la interacción de la materia con la luz y analizando la diferencia entre la intensidad de luz aplicada (I0) y la intensidad de luz transmitida (I).
La parte dela molécula que es responsable de la absorción de la luz, se denomina cromóforo, que puede ser un grupo funcional o, en algunos casos, toda la molécula y se caracteriza, en general, por la presencia de dobles enlaces, normalmente conjugados.
En el estado normal (fundamental) de la molécula, los electrones están en los orbitales ( y ( enlazantes, y hay un número par de ellos, salvo si es unradical. Existen también electrones no enlazantes, por ejemplo en puentes de H y valencias libres; que se sitúan en el orbital (, entre el ( y el (*.
Las transiciones que se pueden dar al excitar la molécula son ( ( (* y ( ( (*. Las transiciones ( ( (* y ( ( (* están prohibidas, su probabilidad es cero, dado que los orbitales ( y ( son perpendiculares entre sí.
Las transiciones de menor energía (y portanto de mayor () son las ( ( (* y corresponden a dobles enlaces ( -C=C- ; -C=O; etc.). Estas transiciones son las más habituales, junto con las ( ( (*, en la espectroscopía UV-V en las que aparecen como hombros en el espectro. Las transiciones ( ( (* son de gran energía (por tanto de baja () y no pueden recogerse en espectrofotómetros convencionales.
Análisis cuantitativo
La medida máscomún de absorción de luz es la Absorbancia (A), también denominada densidad óptica (DO). La absorbancia se define como:
A = log I0 / I
en donde, I0 es la intensidad de la luz monocromática incidente sobre la muestra e I es la intensidad de la luz transmitida por la muestra.
Existe una dependencia lineal entre la Absorbancia (A) y la concentración (C), regulado por la ley de Lambert-Beer,...
Introducción
La espectrofotometría es una de las técnicas más habituales y versátiles en el campo de la investigación biológica, ya que permite determinar, no sólo cualitativa y cuantitativamente muchos compuestos, sino seguir la cinética de reacciones enzimáticas, claves en los diversos procesos de interés biológico.
Fundamentos teóricos
Según la teoría ondulatoriade Maxwell, la luz ordinaria se presenta como una vibración electromagnética que viaja en línea recta a una velocidad uniforme, 3 x 108 ms-1 en el vacío, siendo la dirección de vibración de la onda perpendicular a la dirección de su propagación.
Una ecuación muy simple relaciona esa velocidad, c, con las otras características ondulatorias, como son:
( = longitud de onda
( = frecuencia delas mismas
c = (() (()
Así mismo, desde principios de siglo, y con la aparición de la teoría cuántica, a la luz se la considera también como una corriente de paquetes discretos de energía que denominamos fotones. La cantidad de energía asociada a cada fotón depende de la frecuencia de la luz, de acuerdo con la ley de Planck:
E = (h)(() y, por tanto, según lo anterior
E = (h) (c) / ( siendoh la constante de Planck = 6,626 x 10-34 J. s
La luz blanca engloba distintos componentes, cada uno de ellos con una longitud de onda (color) diferente, como pone de manifiesto su dispersión a través de un prisma. Una radiación electromagnética monocromática, contiene exclusivamente una sola longitud de onda (() determinada. Es con estas radiaciones monocromáticas con las que se trabaja enespectrofotometría.
Espectroscopía ultravioleta-visible (UV-V)
Los electrones en una molécula, al igual que en los átomos, tienden a ocupar los niveles más bajos de energía potencial, es lo que se llama estado fundamental.
La interacción de átomos y moléculas con radiaciones de diferentes longitudes de onda se plasma en: estados excitados que darán lugar a los espectros de absorción, cuandolas moléculas absorben cuantos discretos de energía de diferentes (, y a los espectros de emisión, cuando emiten dichos cuantos.
La espectroscopía UV-V, como la IR (infrarroja), es una técnica que mide la absorción, registrando por tanto la interacción de la materia con la luz y analizando la diferencia entre la intensidad de luz aplicada (I0) y la intensidad de luz transmitida (I).
La parte dela molécula que es responsable de la absorción de la luz, se denomina cromóforo, que puede ser un grupo funcional o, en algunos casos, toda la molécula y se caracteriza, en general, por la presencia de dobles enlaces, normalmente conjugados.
En el estado normal (fundamental) de la molécula, los electrones están en los orbitales ( y ( enlazantes, y hay un número par de ellos, salvo si es unradical. Existen también electrones no enlazantes, por ejemplo en puentes de H y valencias libres; que se sitúan en el orbital (, entre el ( y el (*.
Las transiciones que se pueden dar al excitar la molécula son ( ( (* y ( ( (*. Las transiciones ( ( (* y ( ( (* están prohibidas, su probabilidad es cero, dado que los orbitales ( y ( son perpendiculares entre sí.
Las transiciones de menor energía (y portanto de mayor () son las ( ( (* y corresponden a dobles enlaces ( -C=C- ; -C=O; etc.). Estas transiciones son las más habituales, junto con las ( ( (*, en la espectroscopía UV-V en las que aparecen como hombros en el espectro. Las transiciones ( ( (* son de gran energía (por tanto de baja () y no pueden recogerse en espectrofotómetros convencionales.
Análisis cuantitativo
La medida máscomún de absorción de luz es la Absorbancia (A), también denominada densidad óptica (DO). La absorbancia se define como:
A = log I0 / I
en donde, I0 es la intensidad de la luz monocromática incidente sobre la muestra e I es la intensidad de la luz transmitida por la muestra.
Existe una dependencia lineal entre la Absorbancia (A) y la concentración (C), regulado por la ley de Lambert-Beer,...
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