Espectrofotometria

te aEspectrofotometría, curva de calibración y determinación de proteínas por el método de Biuret.
Diego Figueroa, Rodrigo Gómez, Renato Espinoza. Fecha: 01 -05-2012

Resumen:
La espectrofotometría es el método de análisis más usado en las investigaciones químicas y bioquímicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una soluciónque contiene una cantidad desconocida de soluto, comparada con una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia (estándar). En este análisis en particular se realizo una curva de calibración con las absorbancias medidas por el equipo a concentraciones exactamente conocidas de un estándar en un mismo volumen, posteriormente se midieron las absorbancia de un blanco y de muestras conniveles proteicos desconocidos, mediante el análisis se propone a determinar la concentración de estas muestras, esperando como resultado que la absorbancia sea directamente proporcional en función de la concentración de proteínas, esto quiere decir que a medida que aumenta la concentración de proteínas en la solución, la absorbancia también aumenta. Todo esto se comprobó mediante la realización de unacurva de calibración con un estándar a concentraciones determinadas, confirmando lo dicho anteriormente respecto del aumento proporcional de la absorbancia medida.

Introducción:
Existen biomoléculas las cuales no tienen la capacidad de absorber una cierta intensidad de luz ya sea en el rango visible o ultra violeta del espectro de luz, por lo cual necesitan de compuestos que le den estacaracterística estos compuestos se denominan cromóforos. Para determinar la presencia del complejo biomolécula-cromóforos se utiliza la técnica de espectrofotometría, basándose en la absorciometría, en la cual es necesario tener una longitud de onda fija. La espectrofotometría consiste en incidir un haz de luz monocromático sobre una solución donde se quiere determinar la cantidad de proteínascontenidas en esta. El instrumento que se utiliza para medir la absorbancia total en una muestra de proteínas se denomina espectrofotómetro el cual permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad conocida de proteínas, y una que contiene una cantidad desconocida de la misma molécula.

Un espectrómetro consiste en: una fuente de radiación que tieneintensidad constante en el rango de longitud de onda que cubre (usualmente es lámpara de tungsteno para luz visible, y deuterio para ultravioleta), un compartimiento para la muestra, un monocromador que separa la banda de longitud de onda deseada del resto del espectro y la dispersa al compartimiento de la muestra, y un fotodetector, que mide cuantitativamente la radiación que pasa por la muestra. Parapoder detectar en la solución la presencia de proteínas es necesario utilizar el reactivo de Biuret (CuSO4) como cromóforo, coloreando la solución azul-violeta, ocupando una longitud de onda de 546 nm. La luz que no fue absorbida es captada por un detector la cual nos da el porcentaje de luz que la muestra no fue capaz de absorber, la cual se conoce como transmitancia. Así podemos calcular laabsorbancia de las proteínas presentes en las soluciones. Reacción de Biuret: Si a una solución de proteína se le agrega una solución alcalina de sulfato cúprico (CuSO4) se formará una complejo entre el ion cúprico y los enlaces peptídicos, lo que trae consigo la aparicion de una coloración violeta-púrpura, la cual presenta un máximo de absorción a 540 nm.

Figura 1. Violeta-púrpura Complejoproteína-Cu(II) Mediante este método en la sesión experimental, usando la técnica de espectrofotometría y la reacción con el método de Biuret para proteínas, se espera la medición cuantitativa de la concentración de proteínas de muestras con niveles desconocidos, posterior a la determinación de una curva de calibración con un estándar de proteínas. Con el experimento se esperan obtener los niveles...