Espectrometria

8. Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas
Nieves Abril Díaz1, J. Antonio Bárcena Ruiz1, Emilio Fernández Reyes1, Aurora Galván Cejudo1, Jesús Jorrín Novo1, José Peinado Peinado1, Fermín Toribio Meléndez-Valdés1, Isaac Túnez Fiñana2
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Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa,14071-Córdoba, 2 Facultad de Medicina, Avda. Menéndez Pidal s/n, 14004-Córdoba.

RESUMEN

La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipode medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. En esta práctica se darán a conocer las características generales y conceptos relacionados con la espectrofotometría. A continuación y tras la explicación del funcionamiento del espectrofotómetro se harán espectros deabsorción con el fin de determinar la longitud de onda donde la muestra presenta la máxima absorción, y tras realizar las correspondientes rectas de calibrado se cuantificarán las concentraciones de distintas biomoléculas. Palabras clave: Absorbancia; espectro; rectas de calibrado. transmitancia; colorimetría; cromóforo;

Abreviaturas empleadas. A: Absorbancia; 4-AP: 4-Aminoantipirina; FMN: flavinmononucleótido; FMNH2: forma reducida del flavin mononucleótido; I: intensidad de luz; N-NEDA: N-Naftol-1-etilendiamino; p-NP: p-nitrofenol; POD: Peroxidasa; T: transmitancia; UV: luz ultravioleta. 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS El estudio a nivel bioquímico de cualquier biomolécula requiere la utilización de técnicas analíticas que permitan su determinación cualitativa y cuantitativa, así como sucaracterización físico-química y biológica. Uno de los métodos más sencillos, accesibles, útiles y utilizados es la espectroscopía, en general, y la espectroscopía ultravioleta-visible, en particular. Se pueden identificar y cuantificar biomoléculas en solución y en muestras biológicas, con el empleo

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de reactivos específicos que reaccionan con el compuesto a analizar y forman un productocoloreado que permite detectarlo en muestras complejas. El fundamento de la espectroscopía se debe a la capacidad de las moléculas para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UVvisible. Las longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura atómica y de las condiciones del medio (pH,temperatura, fuerza iónica, constante dieléctrica), por lo que dicha técnica constituye un valioso instrumento para la determinación y caracterización de biomoléculas. Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía interna. Esto permite poner en funcionamiento ciclos vitales como la fotosíntesis en plantas y bacterias. Cuando la luz (considerada como energía) esabsorbida por una molécula se origina un salto desde un estado energético basal o fundamental, E1, a un estado de mayor energía (estado excitado), E2. Y sólo se absorberá la energía que permita el salto al estado excitado. Cada molécula tiene una serie de estados excitados (o bandas) que la distingue del resto de moléculas. Como consecuencia, la absorción que a distintas longitudes de onda presentauna molécula -esto es, su espectro de absorciónconstituye una seña de identidad de la misma. Por último, la molécula en forma excitada libera la energía absorbida hasta el estado energético fundamental.
Figura 1. Diagrama de niveles de energía en una molécula. La absorción de energía luminosa hace que la molécula pase desde un estado fundamental (E1) a otro excitado (E2). Posteriormente la...