ESPECTROSCOPIA, OBTENCIÓN DE ESPECTRO DE ABSORCIÓN Y DETERMINACIÓN CONTENIDO DE CLOROFILA
Páginas: 11 (2629 palabras)
Publicado: 18 de octubre de 2013
Laboratorio n°2 Bioquímica II, IBT
ESPECTROSCOPIA, OBTENCIÓN DE ESPECTRO DE ABSORCIÓN
Y DETERMINACIÓN CONTENIDO DE CLOROFILA
1. RESUMEN
La espectrofotometría ultravioleta-visible (UV-vis) es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luzabsorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma.
En este laboratorio se darán a conocer las características generales y conceptos relacionados con la espectrofotometría.
2.INTRODUCCIÓN
El estudio a nivel bioquímico de cualquier biomolécula requiere la utilización de técnicas analíticas que permitan su determinación cualitativa y cuantitativa, así como su caracterización físico-química y biológica. Uno de los métodos más sencillos, accesibles, útiles y utilizados es la espectroscopia, en general, y la espectroscopia ultravioleta-visible, en particular. Se puedenidentificar y cuantificar biomoléculas en solución y en muestras biológicas, con el empleo de reactivos específicos que reaccionan con el compuesto a analizar y forman un producto coloreado que permite detectarlo en muestras complejas.
El fundamento de la espectroscopia se debe a la capacidad de las moléculas para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Laslongitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura atómica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza iónica, constante dieléctrica), por lo que dicha técnica constituye un valioso instrumento para la determinación y caracterización de biomoléculas.
Las moléculas pueden absorber energía luminosa yalmacenarla en forma de energía interna. Esto permite poner en funcionamiento ciclos vitales como la fotosíntesis en plantas y bacterias. Cuando la luz como forma de energía, es absorbida por una molécula, origina un salto desde un estado energético basal o fundamental, E1, a un estado de mayor energía o estado excitado, E2, sólo absorberá la energía que permita el salto al estado excitado. Cadamolécula tiene una serie de estados excitados (o bandas) que la distingue del resto de moléculas. Como consecuencia, la absorción que a distintas longitudes de onda presenta una molécula - su espectro de absorción- constituye una seña de identidad de la misma. Por último, la molécula en forma excitada libera la energía absorbida para volver a su estado energético fundamental.
Figura 1. Diagrama deniveles de energía en una molécula. La absorción de energía luminosa hace que la molécula pase desde un estado fundamental (E1) a otro excitado (E2). Posteriormente la molécula relaja su energía mediante distintos mecanismos (vibración, rotación, etc.)
En espectroscopia el término luz no sólo se aplica a la forma visible de radiación electromagnética, sino también a las formas UV e IR,que son invisibles. En espectrofotometría de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV cercano, de 195-400 nm) y el visible (400-780 nm).
La región UV se define como el rango de longitud desde onda de195 a 400 nm. Es una región de energía muy alta. Provoca daño al ojo humano así como quemadura común. Los compuestos con dobles enlaces aislados,triples enlaces, enlaces peptídicos, sistemas aromáticos, grupos carbonilos y otros heteroátomos tienen su máxima absorbancia en la región UV, por lo que ésta es muy importante para la determinación cualitativa y cuantitativa de compuestos orgánicos.
Diversos factores-como pH, concentración de sal y el disolvente- que alteran la carga de las moléculas, provocan desplazamientos de los espectros...
ESPECTROSCOPIA, OBTENCIÓN DE ESPECTRO DE ABSORCIÓN
Y DETERMINACIÓN CONTENIDO DE CLOROFILA
1. RESUMEN
La espectrofotometría ultravioleta-visible (UV-vis) es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luzabsorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma.
En este laboratorio se darán a conocer las características generales y conceptos relacionados con la espectrofotometría.
2.INTRODUCCIÓN
El estudio a nivel bioquímico de cualquier biomolécula requiere la utilización de técnicas analíticas que permitan su determinación cualitativa y cuantitativa, así como su caracterización físico-química y biológica. Uno de los métodos más sencillos, accesibles, útiles y utilizados es la espectroscopia, en general, y la espectroscopia ultravioleta-visible, en particular. Se puedenidentificar y cuantificar biomoléculas en solución y en muestras biológicas, con el empleo de reactivos específicos que reaccionan con el compuesto a analizar y forman un producto coloreado que permite detectarlo en muestras complejas.
El fundamento de la espectroscopia se debe a la capacidad de las moléculas para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Laslongitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura atómica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza iónica, constante dieléctrica), por lo que dicha técnica constituye un valioso instrumento para la determinación y caracterización de biomoléculas.
Las moléculas pueden absorber energía luminosa yalmacenarla en forma de energía interna. Esto permite poner en funcionamiento ciclos vitales como la fotosíntesis en plantas y bacterias. Cuando la luz como forma de energía, es absorbida por una molécula, origina un salto desde un estado energético basal o fundamental, E1, a un estado de mayor energía o estado excitado, E2, sólo absorberá la energía que permita el salto al estado excitado. Cadamolécula tiene una serie de estados excitados (o bandas) que la distingue del resto de moléculas. Como consecuencia, la absorción que a distintas longitudes de onda presenta una molécula - su espectro de absorción- constituye una seña de identidad de la misma. Por último, la molécula en forma excitada libera la energía absorbida para volver a su estado energético fundamental.
Figura 1. Diagrama deniveles de energía en una molécula. La absorción de energía luminosa hace que la molécula pase desde un estado fundamental (E1) a otro excitado (E2). Posteriormente la molécula relaja su energía mediante distintos mecanismos (vibración, rotación, etc.)
En espectroscopia el término luz no sólo se aplica a la forma visible de radiación electromagnética, sino también a las formas UV e IR,que son invisibles. En espectrofotometría de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV cercano, de 195-400 nm) y el visible (400-780 nm).
La región UV se define como el rango de longitud desde onda de195 a 400 nm. Es una región de energía muy alta. Provoca daño al ojo humano así como quemadura común. Los compuestos con dobles enlaces aislados,triples enlaces, enlaces peptídicos, sistemas aromáticos, grupos carbonilos y otros heteroátomos tienen su máxima absorbancia en la región UV, por lo que ésta es muy importante para la determinación cualitativa y cuantitativa de compuestos orgánicos.
Diversos factores-como pH, concentración de sal y el disolvente- que alteran la carga de las moléculas, provocan desplazamientos de los espectros...
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