Espectroscòpia D'Emissió: Fluorescència

TEMA 7. ESPECTROSCÒPIA D’EMISSIÓ: FLUORESCÈNCIA

 

Introducció
 
L'espectrometria
  de
  fluorescència
  (fluorometria
  o
  espectrofluorimetria)
  és
  un
  tipus
  d'espectroscòpia
  electromagnètica
  que
  analitza
  la
  fluorescència
  d'una
  mostra.
  Es
  tracta
  d'utilitzar
  un
  feix
  de
  llum,
  en  general
 llum
 UVA,
 que
 excita
 els
 electrons
 de
 les
 molècules
 de
 certs
 compostos
 i
 provoca
 que
 emetin
  llum
 de
 menor
 energia,
 generalment
 en
 el
 visible
 (encara
 que
 no
 necessàriament).
 
  L’absorció
  d’energia
  lumínica
  per
  part
  d’un
  electró
  per  passar
  a
  un
  estat
  excitat
  és
  un
  procés
  extremadament
 ràpid:
 10-­‐15s.
 Després
 que
 l’electró
 hagi
 estat
 excitat,
 la
 tornada
 a
 un
 nivell
 d’energia
  inferior
  té
  lloc
  en
  dues
  etapes:
  (1)
  baixada
  entre
  estats
  vibracionals,
  a
  una
 velocitat
  de
  10-­‐12s
  i
  (2)
  baixada
  de
  l’estat
  vibracional
  inferior
  a
  un
  nivell
  de
  l’estat
  basal,
  a
  una
  velocitat
  de
  10-­‐8s.
  Aquesta
  segona
 transició
 és
 la
 fluorescència.
 El
 procés
 es
 mostra
 en
 el
 Diagrama
 de
 Jablonsky:
 
 
 
  
 
 
 
 
  L’energia
 emesa
 al
 tornar
 sempre
 és
 menor
 a
 l’energia
 absorbida
 (la
 tornada
 és
 més
 curta
 que
 l’anada)
  ja
  que
  se’n
  perd
  entre
  nivells
  vibracionals,
  excepte
  en
  el
  cas
  que
  la
  transició
  s’hagi
  produït
  entre
  el  nivell
 de
 estat
 basal
 més
 elevat
 i
 el
 més
 baix
 de
 l’estat
 vibracional
 o
 viceversa.
  ESPECTRE
 D’EXCITACIÓ
 I
 EMISSIÓ
 D’UN
 FLUORÒFOR
 
  L’espectre
 d’emissió
 està
 desplaçat
 a
 longitud
 d’ona
 majors
  perquè
 és
 de
 menor
 energia.
  El
 punt
 on
 coincideix correspon
 a
 les
 transicions
 entre
 l’estat
  basal
 més
 elevat
 i
 l’estat
 vibracional
 més
 baix,
 o
 al
 revés.
 
 
 
  FLUORÍMETRES
 i
 ESPECTROFLUORÍMETRES
  Els
  fluorímetres
  utilitzen
  un
  filtre
  per
  seleccionar
  la
  llum
  incident
  i
  la
  fluorescent,
 mentre
  que
  els
  espectrofluorímetres
 utilitzen
 monocromadors.
 En
 tots
 els
 casos
 se’n
 necessiten
 dos,
 un
 d’excitació
 i
  un
 d’emissió,
 i
 hi
 ha
 dos
 eixos
 òptics.
 
  1
 

L’esquema
 és
 el
 següent:
  La
 llum
 d'una
 font
 d'excitació
 passa
 a
 través
 d'un filtre
 o
 monocromador
 i
 incideix
 sobre
 la
 mostra.
 Una
  part
  de
  la
  llum
  incident
  és
  absorbida
  per
  la
  mostra
  i
  algunes
  de
  les
  molècules
  de
  la
  mostra
  produeixen
  una
 fluorescència.
 La
 llum
 fluorescent
 és
 emesa
 en
 totes
 les
 direccions. Part
 d'aquesta
 llum
 fluorescent
  passa
 a
 través
 d'un
 segon
 filtre
 o
 monocromador
 i
 arriba
 a
 un
 detector,
 el
 qual
 molt
 sovint
 es
 troba
 a
  90°
 respecte
 el
 feix
 de
 llum
 incident
 per
 evitar
 que
 la
 llum
 reflectida
 o
 que
 ha
 travessat...