Esperar esperar si los frutos son dulces

2. TEMA: Extracción de ADN.

3. OBJETIVOS.
3.1. General: Realizar la extracción de ADN de muestra foliar fresca de Acelga (Beta vulgaris) con DNA Zol Reagent, como estudio introductorio y base de las técnicas moleculares.
3.2. Específico: Conocer el protocolo a seguir para realizar extracción de ADN de muestras vegetales, para así poder aplicarlo en un posterior análisis que requiera delmismo.

4. INTRODUCCIÓN.
El ADN contiene toda la información necesaria para construir células, nos permite la continuidad genética y el desarrollo normal gracias a la replicación exacta de la información. La información en el ADN está organizada en unidades hereditarias denominadas genes. El DNA zol, es un reactivo para el aislamiento de genes en los vegetales. Esta solución de DNA zol contieneguanidina y detergente, el cual promueve la precipitación del ADN. En la extracción del ADN, deben romperse primeramente la pared celular y las membranas plasmáticas, para ingresar al núcleo de la célula. Luego se rompe la membrana del núcleo para que quede el ADN libre, y en último lugar hay que cuidar al ADN de enzimas las cuales pueden degradar, y para poder aislar al ADN necesitamos que seprecipite con etanol. El ADN aislado puede ser usado en la biotecnología, en clonado molecular, PCR, Southern Blot, hibridación dot blot, y otras aplicaciones de biología molecular.




5. MATERIALES.
Instrumentos: Reactivos:
- Mortero. - Nitrógeno líquido [N2(l)].
- Émbolo. - DNA Zol Reagent.
- Micropipetas. - Etanol 99%.
- Puntas de: 1ml, 10 ml, 20ml. - TE: Tris(Ph=8).
- Tubos Eppendorf. - Cloroformo.
- Marcador de vidrio.
- Gradilla.
- Vasos de precipitación.
- Espátula.
Equipos: Muestra:
- pH-metro. - Hojas de Acelga (Beta vulgaris)
- Centrífuga (refrigerada). fresca.
6. MÉTODO.
Se tomó las hojas frescas de Acelga y evitando poner trozos demasiado grandes y con nervaduras, en el mortero previamente congelado, se maceróy trituró el tejido con una cantidad adecuada de Nitrógeno líquido. Se obtuvo de éste proceso un polvo verde agua, el cual se lo transfirió rápidamente a tubos Eppendorf de 1,5 ml con ayuda de la espátula, para evitar su oxidación. Posteriormente se agregó al tubo 1 ml de DNA zol haciendo uso de la micropipeta, después se homogenizó por inversión 2 veces durante el lapso de 10 minutos, para asílograr la ruptura de membranas de las células existentes en la muestra.
Pasado el tiempo de incubación, se agregó 300 ml de cloroformo (CH3Cl), y una vez mezclado en el tubo, se lo centrifugó a 14000 RPM en la centrifuga a 4°C por el tiempo de 10 minutos.
Después de obtener las tres fases en el tubo, producto de la centrifugación, se extrajo el sobrenadante para pasarlo a uno nuevo con ayuda de lamicropipeta.
Seguidamente, se añadió 0,5 ml de etanol (99%) por 1 ml de DNA zol usado procediendo a homogeneizarlo por inversión nuevamente e incubarlo por 3 minutos, para a continuación centrifugarlo a 4000 RPM por el lapso de 2 minutos a 4°C. Al salir de la centrífuga se presenció un precipitado de color blanquecino que se pegó en un lado del tubo, lo que permitió eliminar el sobrenadante parasu posterior lavado. Éste procedimiento (Lavado) que se repitió por 2 veces consistió en agregar 1 ml de etanol (70%) al precipitado, y en cada lavado se invirtió el tubo de 3 a 6 veces para eliminar el etanol, y se almacenó los tubos verticalmente por 30 segundos para depositar el ADN en el fondo.
Para finalizar, el proceso de suspensión se lo realizó empezando por el secado del ADN atemperatura ambiente por 15 minutos. Se disolvió el Pellet en TE: Tris (Ph=8).

7. RESULTADOS.
- Lisis Celular y Homogenización:
- Purificación o Centrifugación:
- Precipitación de ADN:
- Lavado de ADN:
- Solubilización de ADN:
- Se peso 50 mg de hoja fresca de acelga, se pulverizo, macero, trituro el tejido con N2 líquido hasta obtener un polvillo verdoso


- Se lo coloco a un tubo...