Espintrónica

TRABAJO PRÁCTICO Nº5

GLUCÓGENO HEPÁTICO: EFECTO DEL AYUNO

INTRODUCCION

Los carbohidratos, uno de los mayores grupos de sustancias orgánicas de la naturaleza, constituyen la base de varias industrias importantes, incluyendo la manufactura de azúcar, papel, fibras textiles, plásticos, alimentos, fermentación y en menor extensión drogas, vitaminas y productos químicos.
En todas lascélulas vivas los carbohidratos son la fuente central de energía necesaria para realizar trabajo mecánico y reacciones químicas.
Son de especial significado en plantas, las cuales contienen desde un 50 % a un 80 % de su peso seco.
Los polisacáridos desempeñan dos funciones principales: como reserva de combustible y como elementos estructurales. Entre los polisacáridos de reserva, el almidón es el quemás abunda en las plantas y el glucógeno en los animales, siendo la celulosa el material estructural más importante en los vegetales.
El glucógeno, un polisacárido de la D-glucosa con enlaces alfa 1—4, es la principal forma de almacenar carbohidratos. Abunda en el hígado y puede llegar a constituir el 10 % de su peso húmedo.
La determinación cuantitativa y cualitativa de monosacáridos es un pasoimportante en la mayoría de las investigaciones en la que se ven involucrados los glúcidos. Los métodos colorimétricos basados en la determinación de grupos reductores son empleados comúnmente por su sensibilidad, alta especificidad y rápida ejecución.
El análisis cuantitativo del glucógeno presente en un órgano requiere su previo aislamiento, de modo de eliminar otras moléculas que puedeninterferir en su determinación. Las proteínas y ácidos nucleicos precipitan cuando el homogenato del tejido es sometido a la acción de un agente desnaturalizante como el ácido tricloroacético (TCA), lo que permite su rápida separación. El glucógeno que se encuentra en la solución remanente precipita cuando es deshidratado por el agregado de etanol y sal, con lo cual se completa su purificación.
Elmétodo elegido en este trabajo práctico para la determinación de glucógeno se basa en la medición del poder reductor de la glucosa que lo compone.

Azúcares reductores: son aldosas libres o con su OH anomérico no comprometido en la unión acetálica. Las unidades de glucosa se obtienen por medio de la hidrólisis ácida del mismo. El poder reductor se mide en forma indirecta por la reacción deSomogy-Nelson: en una primera etapa el ion cúprico se reduce en medio alcalino en caliente por el OH anomérico de la glucosa, la cual se oxida. En el reactivo de Somogy se agrega tartrato como complejante del Cu2+ para que no precipite como Cu(OH)2 en medio básico. En una segunda etapa, por acción del Cu2O sobre el reactivo de Nelson (reactivo arseno-molíbdico) se forma un complejo coloreado, en el que el Mose ha reducido. Es justamente ese complejo el que se determina espectrofotométricamente a 540 nm.

Objetivo:

Aislar y cuantificar el glucógeno de hígado de ratones normales y ayunados.

METODOLOGIA

Materiales
Homogenatos de ratón adulto normal y ayunado
Solución de TCA 50 % m/v
HCl 6 M
NaOH 3,6 M
Solución de glucosa 0,1 mg/ml
Reactivo de Somogy. Rvo A y B (En el momento de usarmezclar 4 partes de A y 1 parte de B)
Reactivo de Nelson
Etanol absoluto
Cloruro de sodio

Procedimiento
Se trabajará con los homogenatos de los hígados de ratón (normal y ayunado) preparados en el primer trabajo práctico.
a) Extracción del glucógeno
Se toman 1 ml del homogenato y se le agrega 0,5 veces el peso del órgano de TCA 50 % agitando con varilla.
Se centrifuga 10 min a 3000 rpm.(a 4ºC) para la precipitación de ácidos nucléicos y proteínas por acción del TCA
Al sobrenadante se le agrega 2,5 volúmenes de etanol y algunos cristales de sal, calentando a baño María (80 ºC) durante 20 minutos. El alcohol, la sal y el calor son agentes deshidratantes.
Se enfría y se centrifuga a 10000 rpm durante 10 minutos, y el precipitado (glucógeno) se lo resuspende en 1 ml de agua...