Estrategias generales para la purificación de proteínas en vegetales
Páginas: 5 (1097 palabras)
Publicado: 20 de abril de 2013
ESTRATEGIAS GENERALES PARA LA PURIFICACION E IDENTIFICACIÓN DE PROTEINAS EN FISIOLOGIA VEGETAL
¿Para qué purificar proteínas?
Para entender que está pasando en la célula y entre las células. Reconstrucción de rutas metabólicas. Son necesarios enzimas puros para estudiar la cinética, regulación de la reacción etc.
Para estudiar desviaciones del metabolismo normal.
Purificación de enzimaspara su uso como biotacalizadores (lipasas, proteasas, glucosa isomerasa…), uso en terapeutica (insulina, interleukinas)
Purificación de proteina recombinante, ensayos de transformación genetica.
Y muchas otras razones…
La purificación de una proteína que no ha sido previamente purificada es un proceso casi empírico que ha de guiarse tanto por protocolos previamente establecidos como por elsentido común. El grado de pureza requerido depende de la finalidad de la proteína purificada. Los procesos de purificación se caracterizan por comenzar con una primera etapa de extracción de proteinas, seguida de unas fases de purificación y comprobación de la actividad enzimática/proteína buscada.
1.- EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS
No debemos olvidar que el propósito final es purificar una proteínau obtener una actividad enzimática específica, por que en todo momento deberemos procurar trabajar en condiciones que preserven las proteínas. Durante todo el proceso deberemos de trabajar con las muestras en hielo para conservarlas y a la vez inhibir proteasas.
El primer paso, obligado para cualquier purificación, es la liberación de proteínas. Para ello deberemos homogeneizar el tejido(mecánicamente, enzimaticamente, choque osmótico, sonicación, etc.) en un tampón de extracción adecuado. La función de este tampón es estabilizar las proteínas y evitar la acción de proteasas.
En un primer paso separaremos las proteínas hidrosolubles de las liposolubles mediante centrifugación:
Proteínas hidrosolubles: permanecen en solución en solventes acuosos y se pueden separar de la parte nosoluble mediante centrifugación.
Proteínas liposolubles: en el extracto crudo suelen encontrarse asociadas a restos de membranas de las que se pueden liberar mediante extracción con agua, con detergentes o mediante la rotura ultrasónica de la membrana.
Al tampón de extracción con las proteínas sin ningún paso de purificación se le denomina extracto crudo. Realizaremos un primer ensayo deactividad.
2.- METODOS GENERALES DE SEPARACIÓN
2.1.- Inmunoprecipitación
Proceso rápido y específico de separación proteica mediante precipitación. Requiere la utilización de anticuerpos contra esa proteína, por lo que no suele ser aplicable en la purificación de proteínas nuevas. La unión Ag-Ac causa la precipitación del complejo, separándolo del extracto crudo.
Abbas, Litchman & Pober,Cellular and Molecular Inmunology, W.B. Saunders, 1999. Figure A-2
2.2.- Purificación de proteínas asociadas a membrana
Proteínas adheridas: se emplean altas concentraciones salinas, que desestabilizan las uniones no covalentes.
Proteínas asociadas a membrana: pueden liberarse mediante el empleo de fosfatasas, aunque muy probablemente perderemos la actividad en la purificación. Para evitaresto podemos emplear detergentes, siendo complicada la purificación posterior.
3.- SEPARACIÓN POR TÉCNICAS CROMATOGRAFICAS
La cromatografía es un método físico de separación en el que los compuestos a separar se distribuyen entre dos fases:
Fase estacionaria, de gran área superficial, que puede ser sólida o líquida, estando en este caso dispuesta sobre un sólido que le sirva desoporte.
Fase móvil, fluido que pasa a través de la fase estacionaria. Puede ser liquida o gaseosa.
Los compuestos eluidos (que han atravesado la fase estacionaria) son transportados por la fase móvil a un detector que los registra en forma de curvas gausianas (forma de campana). Se utiliza un detector UV seleccionado a 280 nm ya que las proteínas poseen un máximo de absorción aproximadamente a...
¿Para qué purificar proteínas?
Para entender que está pasando en la célula y entre las células. Reconstrucción de rutas metabólicas. Son necesarios enzimas puros para estudiar la cinética, regulación de la reacción etc.
Para estudiar desviaciones del metabolismo normal.
Purificación de enzimaspara su uso como biotacalizadores (lipasas, proteasas, glucosa isomerasa…), uso en terapeutica (insulina, interleukinas)
Purificación de proteina recombinante, ensayos de transformación genetica.
Y muchas otras razones…
La purificación de una proteína que no ha sido previamente purificada es un proceso casi empírico que ha de guiarse tanto por protocolos previamente establecidos como por elsentido común. El grado de pureza requerido depende de la finalidad de la proteína purificada. Los procesos de purificación se caracterizan por comenzar con una primera etapa de extracción de proteinas, seguida de unas fases de purificación y comprobación de la actividad enzimática/proteína buscada.
1.- EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS
No debemos olvidar que el propósito final es purificar una proteínau obtener una actividad enzimática específica, por que en todo momento deberemos procurar trabajar en condiciones que preserven las proteínas. Durante todo el proceso deberemos de trabajar con las muestras en hielo para conservarlas y a la vez inhibir proteasas.
El primer paso, obligado para cualquier purificación, es la liberación de proteínas. Para ello deberemos homogeneizar el tejido(mecánicamente, enzimaticamente, choque osmótico, sonicación, etc.) en un tampón de extracción adecuado. La función de este tampón es estabilizar las proteínas y evitar la acción de proteasas.
En un primer paso separaremos las proteínas hidrosolubles de las liposolubles mediante centrifugación:
Proteínas hidrosolubles: permanecen en solución en solventes acuosos y se pueden separar de la parte nosoluble mediante centrifugación.
Proteínas liposolubles: en el extracto crudo suelen encontrarse asociadas a restos de membranas de las que se pueden liberar mediante extracción con agua, con detergentes o mediante la rotura ultrasónica de la membrana.
Al tampón de extracción con las proteínas sin ningún paso de purificación se le denomina extracto crudo. Realizaremos un primer ensayo deactividad.
2.- METODOS GENERALES DE SEPARACIÓN
2.1.- Inmunoprecipitación
Proceso rápido y específico de separación proteica mediante precipitación. Requiere la utilización de anticuerpos contra esa proteína, por lo que no suele ser aplicable en la purificación de proteínas nuevas. La unión Ag-Ac causa la precipitación del complejo, separándolo del extracto crudo.
Abbas, Litchman & Pober,Cellular and Molecular Inmunology, W.B. Saunders, 1999. Figure A-2
2.2.- Purificación de proteínas asociadas a membrana
Proteínas adheridas: se emplean altas concentraciones salinas, que desestabilizan las uniones no covalentes.
Proteínas asociadas a membrana: pueden liberarse mediante el empleo de fosfatasas, aunque muy probablemente perderemos la actividad en la purificación. Para evitaresto podemos emplear detergentes, siendo complicada la purificación posterior.
3.- SEPARACIÓN POR TÉCNICAS CROMATOGRAFICAS
La cromatografía es un método físico de separación en el que los compuestos a separar se distribuyen entre dos fases:
Fase estacionaria, de gran área superficial, que puede ser sólida o líquida, estando en este caso dispuesta sobre un sólido que le sirva desoporte.
Fase móvil, fluido que pasa a través de la fase estacionaria. Puede ser liquida o gaseosa.
Los compuestos eluidos (que han atravesado la fase estacionaria) son transportados por la fase móvil a un detector que los registra en forma de curvas gausianas (forma de campana). Se utiliza un detector UV seleccionado a 280 nm ya que las proteínas poseen un máximo de absorción aproximadamente a...
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