Estudiante Universitario

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL ECUADOR
NOMBRE: Ángel Vizcaíno
NIVEL: 4
PARALELO: 3

Validación de un ELISA para la cuantificación de
antitoxina tetánica en suero humano
Introducción
El tétanos es causado por la acción de la toxina tetánica o tetanospasmina, una potente neutoroxina que es producida durante el crecimiento del Clostridium tetani. Esta toxina inactivada conformaldehido se convierte en toxoide, el cual ha sido usado como vacuna monovalente en la inmunización de adultos, o como componente de las vacunas combinadas: difteria-pertussis-tétanos (DPT) o difteria-tétanos (DT) para la inmunización de niños.
La vacuna combinada difteria-tétanos (dT) para adultos, contiene la cantidad normal de toxoide tetánico y una cantidad reducida de toxoide diftérico. La DPT esla matriz principal para otras vacunas combinadas y el toxoide tetánico es usado habitualmente como proteína portadora en vacunas conjugadas
La inmunidad contra el tétanos es inducida solamente mediante la inmunización; las personas no inmunizadas corren el riesgo de adquirirla a través de heridas contaminadas, incluyendo el muñón umbilical.
La recuperación clínica de tétanos no protege contranuevas infecciones
La antitoxina tetánica puede ser medida por técnicas in vivo e in vitro
Las pruebas de neutralización in vivo miden directamente la actividad biológica de la antitoxina tetánica en animales de laboratorio, generalmente ratones.
Las pruebas de neutralización son sensibles y específicas, sin embargo son caras, requieren durante mucho tiempo personal altamente entrenado,un gran número de animales y relativamente gran volumen de suero para su ejecución
Materiales y Métodos
Antígeno
Como antígeno de captura se usó toxoide tetánico altamente purificado producido por el Instituto Finlay, con 1320 unidades de floculación por mL (Lf/mL) y 0,73 mg de proteína por mL, lo cual implica una pureza de 1808 Lf/mg de nitrógeno proteico
Suero Estándar
Se preparó apartir de la mezcla de 10 sueros provenientes de donantes de sangre para inmunoglobulina tetánica. Este suero estándar fue cuidadosamente estudiado contra el suero local de referencia mediante la prueba de neutralización en ratones, previamente calibrado contra el segundo estándar internacional de la OMS para antitoxina tetánica y ajustado a 0,96 Unidades Internacionales por mL con albúmina séricahumana al 6%.
La actividad máxima de trabajo fue de 0,016 UI/mL, después de diluido con amortiguador fosfato salino 0.15
Procedimiento ELISA
Se sensibilizaron placas ELISA con 100 µL de toxoide tetánico por pocillo a un concentración de 10 Lf/mL en amortiguador carbonato, bicarbonato de sodio 0,05, pH 9,6. El toxoide no adsorbido se eliminó lavando la placa cuatro veces con 300 µL de AFST porpocillo
La curva de calibración se preparó con seis diluciones doble seriadas del suero estándar en AFST con 3% de leche descremada (AFSTM).
Los sueros de prueba se diluyen inicialmente 1:200 en AFSTM; si la actividad obtenida fue mayor que 3,2 UI/mL se hicieron diluciones mayores, si la actividad fue menor de 0,1 UI/mL se diluyeron 1:20.
Se añadieron 100 µL de cada solución en duplicado a lospocillos y se incubaron las placas 1 hora a 37°C.
Después de lavar como se indicó, se añadieron 100 µL de conjugado por pocillo (anti-IgG humana en cabra: fosfatasa alcalina) diluido 1:2000 en AFSTM y las placas se incubaron nuevamente 1 hora a 37°C. Después de lavar se añade en cada pocillo 100 µL del sustrato p-nitrofenil fosfato a una concentración de 1 mg/mL, diluido en amortiguadordietanolamina 0.92 M, pH 9,8.
Las placas se incubaron entre 20-25 °C por 30 min y las absorbancias se midieron en un lector de placas ELISA
Los valores de absorbancia se transforman a UI/mL con un programa desarrollado por el Centro para el Control de Enfermedades, Atlanta, GA. Se usó la función logistic-log de 4 parámetros para construir la curva de referencia. La validación y determinación...