estudiante

RESUMEN
En esta práctica se realizaron diferentes procedimientos para explorar el efecto dela temperatura, la variación de pH y la presencia de cianuro sobre la actividad
OBJETIVOS:

• Observar la influencia de la temperatura y el pH sobre una reacción enzimática
• Constatar la especificidad de las enzimas
• Examinar el efecto de los iones metálicos pesados sobre la actividad de laα-amilasa
• Determinar el valor de Vm y Km para la α-amilasa


FUNDAMENTO:

Las enzimas son proteínas cuya función es catalizar las muy diversas reacciones que se llevan a cabo dentro de los organismos vivos. Su acción es específica y se afecta por factores tales como la temperatura y el pH del medio, la concentración de enzima y de sustrato, la presencia o ausencia de cofactores y/o inhibidores,etc. En esta práctica se va a ensayar la acción de varios de los factores mencionados sobre la α-amilasa, una enzima que en los seres humanos se encuentra presente en la saliva y en el páncreas.

La α-amilasa (nombre sistemático: 1,4-glucano-glucanohidrolasa; código: 3.2.1.1 de la Unión Internacional de Bioquímica; peso molecular: 45000) hidroliza los enlaces glucosíricos α 1- 4. Estos enlacesse encuentran presentes en el almidón.

El almidón es una mezcla de dos polisacáridos: amilosa y amilopectina. La amilosa con el yodo da una coloración azul oscura que se comunica a todo el almidón. Esta propiedad permite seguir la acción de la α-amilasa sobre el almidón: a medida que éste se va hidrolizando el color azul va desapareciendo hasta llegar a un color amarillo ocre,característico de la solución de yodo cuando la hidrólisis ha sido total:







MATERIALES Y REACTIVOS

1 probeta de 100 ml
2 vasos de precipitados de 100 ml
1 embudo de vidrio
algodón
gradilla con 12 tubos de ensayo
cinta de enmascarar
hielo
termómetro
pipeta de 1 ml
pipeta de 2 ml
agitador de vidrio
probeta de 100 ml

50 ml suspensión de almidón al 0.5%
10 ml reactivo de Lugol
50 mlsolución amortiguadora de pH 3.0
50 ml solución amortiguadora de pH 5.0
50 ml solución amortiguadora de pH 6.0
50 ml solución amortiguadora de pH 7.0
50 ml solución amortiguadora de pH 8.0
10 ml pepsina 0.1% (u otra enzima diferente a la α-amilasa)
10 ml ureasa 0.1% (u otra enzima diferente a la α-amilasa)
5 ml cloruro mercúrico al 1%
5 ml nitrato de plomo al 1%


METODOLOGÍAPreparación de la amilasa salival:

Se enjuaga la boca dos o tres veces con agua para eliminar los restos de alimentos. Se miden en una probeta 50 ml de agua destilada y con ellos se enjuaga la boca, en varios buches, por espacio de unos 2 o 3 minutos, cada buche. El liquido recogido se filtra a través de un algodón y 10 ml de este filtrado se diluyen con agua destilada hasta completar 100 ml. Estasolución, que en adelante se denominara amilasa salival, será la que se utilice para la realización de las distintas partes de la práctica.

Influencia de la temperatura sobre la actividad de la amilasa salival

Se rotulan cuatro tubos de ensayo 0, 20, 40, 90. En cada uno se vierten 2 ml de suspensión de almidón al 0.5%. El tubo 0 se coloca, durante 10 minutos, en un baño de hielo; el tubo20 se deja a temperatura ambiente; el tubo 40 y el tubo 90 se colocan respectivamente en un baño de agua a 40 °C y en un baño de agua hirviente, durante 10 minutos, para que el contenido de los tubos adquiera la temperatura correspondiente. A cada tubo, sin retirarlo del baño, se le agregan 0.5 ml de amilasa salival. Se agitan bien los tubos y se dejan durante un minuto a las condiciones detemperatura anteriormente señaladas. Al cabo de este tiempo se colocan cinco gotas del contenido del tubo 0 en una concavidad de una placa de porcelana a la que previamente se le habían adicionado dos gotas del reactivo de Lugol, y se observa el color producido. El mismo procedimiento se repite con el contenido de los tubos 20, 40 y 90. Si el color en la concavidad es amarillo oscuro se da por...