Estudio Cinético De La Α-Amilasa

Práctica 4: Estudio cinético de la α-amilasa

Objetivo
Comprobar la influencia de la concentración de sustrato, de enzima, del pH y de la temperatura en la cinética de la enzima α-amilasa salival.

Introducción
La cinética enzimática tiene por objeto el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas, así como los factores que en ella influyen y los mecanismos por loscuales transcurren.
La velocidad de las reacciones enzimáticas se puede medir:
- por la cantidad de sustrato que desaparece en la unidad de tiempo
- por la cantidad de producto que aparece en la unidad de tiempo
En esta práctica nos basaremos en la desaparición del almidón mediante el seguimiento de la reacción de color que produce el mismo con el Iodo en disolución de Ioduro de potasio (reactivode Lugol).

Materiales
16 tubos de ensayo
4 cajas de Petri
2 vasos de precipitado
baño de agua a 40 ºC
cronómetro
6 goteros Solución del enzima: Se prepara colectando 1 ml de saliva (previo enjuague de la boca con agua destilada) y diluyéndolo hasta 20 mlL con agua destilada.
Disolución de almidón al 0,5 %.
Disolución de Lugol: Se prepara disolviendo 1 g de iodo, 2 g de KI en 200 mlde agua destilada.
Disoluciones tampón de pH 5,0; 7,0 y 8,0.

Procedimiento
1) Efecto de la concentración de enzima:
1. Numera 4 tubos de ensayo del 1 al 4 y añade a cada uno 2 mL de disolución de almidón al 0,5 %. Lleva la temperatura a 40 ºC.
2. Añada a cada tubo 0,1; 0,2; 0,3 y 0,4 mL de disolución de enzima respectivamente, y completa hasta un volumen de 0,5 mL con agua. Añade primero elagua y luego la disolución de la enzima, pues de lo contrario la reacción comenzará a ocurrir. Inmediatamente después de adicionar la solución de enzima al último tubo pon en marcha el cronómetro y comienza a medir el tiempo. La mezcla debe mantenerse a 40 ºC.
3. Cada 5 minutos, durante 30 minutos, ensaya en una caja de Petri la reacción de la solución experimental con el Lugol: para ello extraecon el gotero 3 o 4 gotas de cada tubo de ensayo en reacción (el tubo debe seguir incubándosea 40 ºC), colócalas en una caja de Petri, y luego adiciona una gota del reactivo de Lugol. Observa y anota el color para cada tiempo y cada tubo ensayados.
4. Determina por el procedimiento anterior el tiempo que tarda cada uno de los tubos en no dar reacción alguna con el reactivo de Lugol (la mezcladebe quedarse del color original del Lugol; si deseas puedes adicionar en la caja unas gotas de agua y Lugol para tenerlo como solución de control).
5. Con los datos obtenidos construye la siguiente tabla:
Tubo Volumen de enzima (mL) Tiempo total de reacción (min) Velocidad de la reacción (1/t)
1
2
3
4
6. Con estos datos construye un gráfico de velocidad de reacción (1/t) en eleje de ordenadas, contra concentración de enzima en el eje de abscisas.
2) Efecto del pH
1. Numera 3 tubos de ensayo del 5 al 7 y vierte en cada uno 2 mL de las soluciones tampones de pH 5,0; 6,8 y 8,0.
2. Añade a cada tubo 2 mL de la solución del almidón al 0,5% y 2 mL de la solución de enzima. Incuba a 40 ºC y ensaya la reacción con el Lugol según se indica en el experimento 1).
3. Con losdatos obtenidos saca las conclusiones sobre el pH en el cual el enzima muestra mayor actividad.

3) Efecto de la concentración de sustrato:
1. Numera 4 tubos de ensayo del 8 al 11 y añade a cada uno 0,5; 1,0; 1,5 y 2,0 mL de solución de almidón. Completa el volumen de cada tubo hasta 2,0 mL con agua destilada.
2. Adiciona a cada tubo 0,5 mL de disolución de enzima e incúbalos a 40 ºC.
3.Cada 5 minutos, durante 30 minutos, ensaya la presencia de almidón mediante la reacción con Lugol, de forma similar a como se describe en el experimento 1).
4. Con los datos obtenidos construye la siguiente tabla:
Tubo Volumen de sustrato (mL) Tiempo total de reacción (min) Velocidad de la reacción (1/t)
8
9
10
11
5. Con los datos de la tabla construye un gráfico de velocidad...