Estudio de marcadores moleculares

Marcadores Moleculares de ADN REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA O PCR E INTRODUCCIN AL MEJORAMIENTO VEGETAL ASISTIDO La base terica de la reaccin en cadenas de la polimerasa o PCR fue expuesta en 1971 (Kleppl et al.), pero esta tcnica no produjo demasiado inters hasta mediados de los aos 80 La tecnologa denominada Reaccin en Cadena de la Polimerasa o PCR (Polymerase Chain Reaction) fuedesarrollada por Mullis y colaboradores a mediados de la dcada del ochenta (Saiki et al., 1985 Mullis y Falcona, 1987). El impacto causado en la ciencia por esta tecnologa fue tan grande que le vali el premio Novel de medicina a Kary Mullis en 1993. La tcnica esta basada en la replicacin in vitro del ADN, e imita el proceso natural que ocurre en todas las clulas vivas. Una clula para poder replicar suADN requiere, entre otras cosas, de enzimas que desenrollen la estructura de hlice y separen las cadenas del ADN, una secuencia molde de ADN o templado de simple cadena a copiar, y enzimas que catalicen la unin de los nucletidos a este ltimo. Para poder imitar este proceso, la tcnica de PCR aprovecha las propiedades de desnaturalizacin y renaturalizacin del ADN y provoca, en forma artificial, unaumento y descenso alternado de la temperatura (ciclos) del cctel de reaccin (premix), por medio de un ciclador trmico o termociclador. En el cctel de reaccin o premix, se encuentran todos los elementos necesarios para la replicacin ADN, oligonucletidos cebadores o primers, una ADN polimerasa y nucletidos (dNTPs). En la primer parte del ciclo, el aumento de la temperatura hasta 95 C, produce ladesnaturalizacin del ADN, es decir la separacin de las dos hebras de la doble hlice. En la segunda parte del ciclo comienza a descender la temperatura, lo que permite la unin de las cadenas de simple hebra a los oligonuclotidos (10 a 30 bases) denominadas primers, que actan como cebadores para el inicio de la replicacin. La temperatura en la que se produce la unin del primer a la cadena molde de ADN seconoce como temperatura de annealing, y depende del largo, de la composicin de bases del primer y oscila entre los 50 y 60 C. Esta temperatura es mayor que la que permite la unin de las hebras de ADN separadas (45C), por lo que el primer se hibrida antes con la cadena molde durante el descenso de temperatura. A diferencia de la replicacin de ADN celular, en la que los cebadores reconocidos por laADN polimerasa son secuencias de ARN, los cebadores utilizados en la reaccin de PCR son secuencias de ADN. En la reaccin de PCR, los primers (sintticos) tienen una secuencia que les permite hibridar, en forma especfica, y amplificar la secuencia compredida entre dos primers con la secuencia blanco que el usuario quiere amplificar. Una vez que se produce la hibridacin de los primers, la enzima ADNpolimerasa cataliza la sntesis de una nueva hebra de ADN, incorporando a la cadena en formacin, a travs de uniones fosfodiester, los nucletidos con las bases complementarias a la cadena molde. La enzima responsable de la replicacin en las clulas es la ADN polimerasa. Esta cataliza la unin del grupo OH-3 del extremo del cebador, con el grupo fosfato del deoxiribonucesido trifosfato que seincorpora a la cadena en sntesis a travs de una unin fosfodiester. En la clula la replicacin ocurren a temperatura constante e intervienen distintas enzimas que catalizan todas las reacciones y que son sensibles al aumento de la temperatura ya que, como son protenas, se desnaturalizan y pierden sus propiedades a los 45C. En al reaccin de PCR estos procesos ocurren en un tubo de ensayo sometido avariaciones de temperatura con un mximo de 95 C, y la polimerizacin es conducida por una ADN polimerasa llamada Taq polimerasa obtenida de bacterias termfilas (Thermus aquaticus). Esta enzima tiene su temperatura ptima de catalizacin a 72 C. En la utilizacin de esta enzima se bas el gran descubrimiento de Kan Mullis. Las enzimas utilizadas para la unin de nucletidos en la reaccin de PCR son obtenidas...