Estudio de membrana

MÉTODOS DE ESTUDIOS DE MEMBRANA
1. Las técnicas de fraccionamiento celular permiten el estudio de orgánulos celulares de una forma relativamente intacta fuera de las células. En estas técnicas, las células se rompen suavemente y se separan en diversas fracciones que contienen los orgánulos. Las células pueden romperse mediante varios métodos, aunque la homogeneización es el que se utilizahabitualmente. En este proceso se coloca una suspensión celular en un tubo de vidrio que lleva ajustado un pistón de vidrio especialmente diseño o en un triturador eléctrico. El homogeneizado resultante se separa a continuación en varias fracciones durante un procedimiento llamado centrifugación diferencial. Un instrumento refrigerado denominado ultracentrífuga genera fuerzas centrífugas enormes queseparan los componentes celulares de acuerdo con el tamaño, la superficie y la densidad relativa. Inicialmente, el homogeneizado se hace girar en la ultracentrífuga a una velocidad baja (700-1000 g) durante 10 a 20 minutos. Las partículas más pesadas, como los núcleos, forman un sedimento. Las partículas más ligeras, como los lisosomas, permanecen suspendidas en el sobrenadante, el líquido porencima del sedimento. Se transfiere posteriormente el sobrenadante a otro tubo de centrífuga y se hace girar a una velocidad mayor (15000 a 20000 g) durante 10-20 minutos. El sedimento que se obtiene contiene las mitocondrias, los lisosomas y los peroxisomas. El sobrenadante que contiene los microsomas (vesículas pequeñas cerradas formadas a partir del retículo endoplasmático durante lahomogeneización), se transfiere a otro tubo y se hace girar a 100 000 g durante 60-120 minutos. Los microsomas se depositan en el sedimento y el sobrenadante contiene los ribosomas, varias membranas celulares y gránulos como el glucógeno. Tras volver a centrifugar este último a 200 000 g durante 2 a 3 horas, se recuperan del sedimento los ribosomas y las macromoléculas grandes. Puesto que los pasos iniciales dela centrifugación diferencial no producen preparaciones puras de un organelo particular, casi siempre se requieren pasos adicionales. En muchos casos se logra una purificación adicional mediante la centrifugación de una de las fracciones a través de un gradiente de densidad, lo que distribuye el contenido de la muestra en varias capas de acuerdo con su densidad. Los organelos aislados con esteprocedimiento pueden usarse en sistemas sin células para estudiar gran variedad de actividades celulares, incluida la síntesis de proteínas unidas a la membrana.

2. En la microscopia de fuerza atómica (AFM), se desplaza la punta fina de una sonda microscópica unida a un brazo de palanca flexible a través de una superficie irregular tal como una membrana. Las interacciones electrostáticas y devan der Waals entre la punta y la muestra producen una fuerza que desplaza la sonda arriba y abajo (en la dimensión z) a medida que encuentra colinas y valles en la muestra. Un rayo láser reflejado desde el brazo de palanca detecta movimientos de tan sólo 1 Å. En un tipo de microscopio de fuerza atómica se mantiene constante la fuerza sobre la sonda (en relación a una fuerza estándar, del ordende piconewtons) mediante un circuito de retroalimentación que hace que la plataforma que sostiene la muestra suba o baje para mantener la fuerza constante. Una serie de barridos en las dimensiones x e y (el plano de la membrana) proporciona un mapa de curvas de nivel tridimensional en la superficie con una resolución próxima a la escala atómica (0,1 nm en la dimensión vertical y de 0,5 a 1,0 nm enlas dimensiones laterales).

3. La disposición de las proteínas dentro de las membranas biológicas puede observarse directamente utilizando microscopía electrónica de fractura por congelación. En esta técnica, se corta con un micrótomo una membrana congelada rápidamente. (un micrótomo es un instrumento que se utiliza para realizar cortes finos de especímenes biológicos para su estudio...