Estudio Y Cinetica De La Enzimas

Universidad de Panamá
Facultad de Ciencia Naturales Exactas y Tecnológicas
Escuela de Biología
Informe Nº 4 de Bioquímica
“Preparación y Estudio Cinético de la Invertasa”
Profesor: José Luis Veces S.
Integrantes: Luz Ayarza 8-863-1982
Sean Romaña 8-871-2393
Sidney Polanco 8-858-419

Grupo: 2.2 B
Fecha de realización: 9/11/2012
Fecha de entrega: 16/11/2012

Introducción

Lasacarosa está constituida por la asociación de una molécula de α-D-glucopiranosa y una molécula de β-D-fructofuranosa. Su hidrólisis enzimática, se hace al nivel del puente de oxígeno del lado de la glucosa por medio de una glucosidasa o del lado de la fructosa con la intervención de una β-fructosidasa. En cualquier caso, sea cual sea la enzima que catalice el proceso, la hidrólisis da siempre losmismos productos. Estas enzimas se reúnen bajo el nombre de invertasas. La práctica se realizará en el laboratorio con una β-fructosidasa extraída de la levadura.

La actividad catalítica de un enzima se determina midiendo la velocidad inicial de reacción, que es la pendiente de la curva de progreso en el tiempo cero. Inicialmente, las reacciones transcurren linealmente, pudiéndose tomar lapendiente de esta recta como velocidad inicial. A tiempos más largos, el progreso de la reacción se aparta de la linealidad. Esta caída de la velocidad de reacción se debe a la disminución significativa de la concentración de sustrato, aunque también pueden influir otros factores como el aumento de la concentración de producto, cambios de pH, inactivación del enzima, etc. La máxima fiabilidad en ladeterminación de la actividad de un enzima la suministra el valor de velocidad inicial o velocidad durante el tramo inicial de progreso lineal de la reacción.

Informe Nº 4 de Bioquímica
“Preparación y Estudio Cinético de la Invertasa”
Resumen
* Preparación del Extracto Bruto.
Pese 5g de levadura seca y suspenda en 25 ml de bicarbonato de sodio 0.15 M, deje en baño de agua a 45º C durante24 horas para que se realice la autolisis. A continuación centrifugue la suspensión por 20 minutos, elimine el sedimento y utilice el sobrenadante para las pruebas de actividad enzimática de la Invertasa.
* Dilución del extracto bruto.
Se añadió A continuación a cada tubo se añade 1 ml de la solución de Sucrosa 0.3 M. Todos los tubos se incuban a temperatura ambiente por 10 minutos. Al finaldel periodo se adiciona 1 ml de la solución de tartrato de cobre, se tapan los tubos y se adiciona 1 ml del reactivo de Arsenomolibdato. Complete el volumen hasta 10 ml y lea la absorbancia a 510nm, contra el blanco. La dilución apropiada es aquella que presenta absorbancia en el rango de 0.3 a 0.7. En los ensayos posteriores la actividad será expresada en términos de unidades de absorbancia, comouna medida de la formación de azucares reductoras.
* Efecto de la concentración de la enzima.
Con la dilución apropiada del extracto, se realiza lo siguiente:
Tubo | Amortiguador (pH 4.6) | Agua | Enzima Diluida |
1 | 1.0 ml | 1.3 ml | 0.2 ml |
2 | 1.0 ml | 1.2 ml | 0.3 ml |
3 | 1.0 ml | 1.1 ml | 0.4 ml |
4 | 1.0 ml | 1.0 ml | 0.5 ml |
5 | 1.0 ml | 0.5 ml | 1.0 ml |
6 | 1.0 ml| 1.5 ml | ------------------- |
7 | 1.0 ml | 1.5 ml | 1.0 ml |

* Se añadió a cada tubo 1.0 ml de la solución de Sucrosa 0.3 M.
* Todos los tubos se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
* Al final del periodo se adiciono 1.0 ml de la solución de Tartrato de Cobre y se tapan los tubos con bolitas de quiñar.
* Se colocaron en un baño de agua hirviendo por15 minutos.
* Después del tiempo se procede a retirar y se enfrían los tubos
* Seguidamente se adiciona 1.0 ml del reactivo de Arsenomolibdato.
* Se completo el volumen hasta 10 ml con agua (4.5 ml)
* Con ayuda de un Espectrofotómetro se leyó la absorbancia a 510nm.
* Obtenidos los valores se grafico la concentración de proteína y volumen de la enzima utilizada, contra...