Evaluación Bioquímica y Biológica De Una Hialuronidasa Del Veneno De La Serpiente

AGRADECIMIENTOS

Mi más sincero agradecimiento al Dr. Armando Yarlequé, jefe del laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Biológicas – UNMSM, quién con su asesoramiento, enseñanza y guía hizo posible la realización de esta tesis. Así mismo, a la Mag. Edith Rodríguez, quién guió, colaboró y corrigió muchos de los aspectos del presente trabajo. A los profesores y amigos Mag.Fanny Lazo, Blgo. Orestes Málaga y a la Mag. Carmen Pantigoso por sus importantes sugerencias, enseñanzas y correcciones.

A mis compañeros Gustavo Sandoval y Rosio Inga por todo el trabajo compartido en el laboratorio por su ayuda y amistad.

ABREVIATURAS

Ac H. GlcUA GlcNAc PAGE-SDS BCTA TEMED UDF PLA2

Ácido Hialurónico. Ácido D-glucorónico. Ácido N-acetil-D-glucosamina. Electroforésisen gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio. Bromuro cetil trimetil amonio Tetra etil metilen diamina Unidades DiFerrante Fosfolipasa A2

RESUMEN

En el presente estudio se han evaluado algunas características bioquímicas y biológicas de una hialuronidasa previamente encontrada en el veneno de Lachesis muta, para lo cual fue necesario optimizar el método depurificación. Usando 50 mg de veneno disueltos en búfer acetato de amonio 0,05 M pH 5,0, la hialuronidasa fue separada empleando una cromatografía en Sephadex G100 seguida de una columna de intercambio catiónico en CM Sephadex C -50, utilizando el mismo bufer como eluyente. En este sistema, la enzima se recuperó usando una gradiente de NaCl de 0 a 0,7 M, con un rendimiento de 39.02% y una purificación de 51,4veces. El análisis de pureza por PAGE-SDS reveló una sola banda proteica con peso molecular de 65 kDa. La enzima mostró un pH óptimo de 5,0, un K m de 34,4 µg de ácido hialurónico/ml y un Vmax de 40,9 µg de ácido hialurónico hidrolizado/minuto/mg. Así mismo, la hialuronidasa demostró una dependencia absoluta por los iones Cl - y Br- . En cuanto a la actividad biológica, los ensayos realizados enplacas de agarsangre mostraron que la enzima actúa como un factor difusor que permite la hemólisis por acción de la fosfolipasa del propio veneno. Así también, se ha observado que la inyección por vía subcutánea de la enzima purificada en ratones, no causó ningún efecto hasta las 6 horas usando cantidades de 0,4 hasta 1,6 mg.

ABSTRACT

In the present research some biochemical and biologicalcharacteristics of a hyaluronidase from the venom of Lachesis muta snake were evaluated. In this way the method for purification of this enzyme was improved. 50 mg of whole venom was disolved in 0.05 M amoniun acetate buffer pH 5.0 and applied to Sephadex G -100 gel filtration chromatography followed by CM Sephadex C-50 exchange chromatography using the same buffer. In the last system, the enzymewas recovered after a gradient of NaCl from 0 to 0,7 M with 51,4 folds and 39,02% of yield. The hyaluronidase was achieved as homogeneus band of protein by PAG E-SDS with 65 kDa of molecular weigth. The enzyme registered 5,0 as optimus pH, Km: 34,4 µg of hyaluronic acid/ml and Vmax: 40.9 µg hidrolizade hyaluronic acid/minute/mg. The enzyme showed a total dependence for Cl - and Br - ions. Thebiological activity assays using agar-blood plates showed the hyaluronidase was a spreading factor, because of hemolisis by phospholipase A2 ocurred using the total venom. In addition, any biological effect was observed after inoculation of 0,4 to 1,6 mg of the hyaluronidase on mice.

INTRODUCCIÓN

Debido a las características de su particular geografía, el Perú contiene dentro de sus fronteras a84 de los 117 ecosistemas reportados en el mundo, los cuales dan sustento a una rica flora y fauna que han colocado al país dentro de la lista de las 10 naciones con mayor diversidad de vida en el planeta. En nuestro territorio habitan el 19% de las especies de aves, el 10% de mamíferos, el 9% de anfibios y el 5% de reptiles, entre otras, siendo muchas de éstas endémicas (41). Un gran número de...