Evaluación de cuatro métodos de extracción de ARN

TÉCNICA

Evaluación de cuatro métodos de extracción de ARN viroide
para el diagnóstico molecular de CEVd en Citrus limon
mediante RT-PCR, Dot blot y Northern blot
" Rodolfo Umaña1, Clara Pritsch1, Juan R Arbiza2, Fernando Rivas3, Gabriela Pagliano1
1

Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía, Universidad de la República
Garzón 780, Montevideo, Uruguay
2
Sección Virología, Facultadde Ciencias, Universidad de la República
Iguá 4225, Montevideo, Uruguay
3
Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria, Inia
Ruta 3 Camino al Terrible. Salto, Uruguay
E-mail: rumana@fagro.edu.uy

RESUMEN
En el desarrollo de metodologías moleculares diagnósticas en variedades cítricas propensas a infección viroide, se
precisa la extracción eficiente de ARN, siguiendo criterios de concentracióny pureza. Los contaminantes remanentes
pueden afectar la detección según la herramienta molecular escogida. Esta condición se analiza a partir del espectro
de absorción del ARN; mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) y por los
niveles de intensidad de las señales de Northern blot y Dot blot, en términos de respuesta analítica/sensibilidad. Se
evaluaroncuatro métodos de extracción de ARN, por sus efectos sobre la detección de presencia/ausencia del Citrus
Exocortis Viroid (CEVd) en Citrus limon mediante análisis moleculares diagnósticos: 1) extracción viroide convencional (EVC); 2) fenol/tiocianato de guanidina (FTG); 3) SDS/acetato de potasio (SAP); y 4) formaldehído/SSC (FS).
Los valores del tejido de floema estuvieron entre 7500 ng/μL y 1200ng/μL y los rangos entre 1.3 y 2.0 DO260/280.
La evaluación por aproximaciones de la RT-PCR reflejó las amplificaciones esperadas del genoma completo del
CEVd; sin embargo, aún se discuten los escenarios erráticos. Las hibridaciones no radiactivas revelaron señales de
alta intensidad (132 UR) para el tejido infectado, según el método de EVC, y la definición del límite de positividad
para lapresencia de infección (78 UR). Las herramientas basadas en hibridaciones moleculares interfieren en el
diagnóstico, por la rigurosidad del protocolo y las condiciones del ARN molde. La extracción viroide como punto de
partida de una detección exitosa y los métodos moleculares ensayados, mostraron las posibilidades diagnósticas de
la asociación de Northern blot con la EVC.
Palabras clave: CEVd,diagnóstico, Northern blot no radiactivo, RT-PCR, viroides cítricos
Biotecnología Aplicada 2013;30:125-130

ABSTRACT
Evaluation of four viroid RNA extraction methods for the molecular diagnosis of CEVd in Citrus limon using
RT-PCR, Dot blot and Northern blot. An efficient method for RNA extraction that leads to RNA high yield and purity
is a technical issue relevant for development and optimization ofmolecular diagnostic methods aimed to detect viroid
infections in citrus varieties. Residual contaminants may affect RNA detection depending on the molecular diagnosis
approaches. This condition can be evaluated through RNA absorption spectrum analysis. Functionally, it is assessed
through observation of RT-PCR amplification products and Northern blot and Dot-blot signal intensities, displaying
levelsof analytical response/sensitivity. Four RNA extraction methods were evaluated to determine their effects on the
capacity to detect viroid CEVd presence/absence in Citrus limon through four molecular diagnostic approaches: 1)
conventional viroid extraction (CVE); 2) phenol/guanidine thiocyanate (PGT), 3) SDS/potassium acetate (SPA); and 4)
formaldehyde/ SSC (FS). Phloem tissue quantificationsshowed values between 7500 ng/μL and 1200 ng/μL and ranged
1.3-2.0 OD260/280. Evaluations through RT-PCR showed the expected amplifications of the entire CEVd genome, but
erratic scenarios still remained. Non-radioactive probe hybridization techniques revealed high intensity signals (132
RU) for infected tissue, by using the CVE method, and a positivity cut-off for the presence of infection was...