Evaluación y optimización de adn
Páginas: 5 (1027 palabras)
Publicado: 17 de marzo de 2012
EVALUACIÓN Y OPTIMIZACIÓN DE PROCEDIMIENTOS DE EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ADN PARA MUESTRAS DE TIERRA Y SEDIMENTOS.
Comparamos y evaluamos estadísticamente la eficacia de nueve procedimientos de extracción de ADN utilizando dos muestras congeladas y secas de sedimento de suelo de marga y una de sedimento de suelo de marga de humedal con diferente contenido de materia orgánica.Comparaciones por parejas de los nueve procedimientos de extracción, revelaron que la homogeneización en “molino de bolas”, con SDS combinado, bien con cloroformo, bien con fenol, optimizaba tanto la cantidad de ADN extraído como el tamaño molecular del ADN (máximo, de 16 a 20kb). Ni la digestión de lisozimas antes del tratamiento con SDS, ni el tratamiento con isotiocianato de guanadinio, ni la adición deresina de Chelex 100 mejoraron los rendimientos de ADN.
Evaluamos cuatro métodos distintos de purificación de ADN (“unión silícea de ADN”, electroforesis en gel de agarosa, precipitado de acetato amónico, y filtrado en gel Sephadex G-200) para la recuperación de ADN y la eliminación de inhibidores de PCR de extractos crudos (en bruto). La purificación Sephadex G-200 resultó ser el mejor métodopara eliminar sustancias inhibidoras del PCR, minimizando la perdida de ADN durante la purificación. Para este tipo de muestras, la recuperación óptima de ADN requiere homogeneización breve, y a baja velocidad, en “molino de bolas”, en presencia de una mezcla de SDS y cloroformo, con “amortiguador de fosfato, seguida de una columna centrifugadora de Sephadex G-200.
Las técnicas de lisisdirecta, han sido utilizadas en mayor medida porque obtienen mayor cantidad de ADN, y presumiblemente, una muestra menos parcial de la diversidad de la comunidad microbiana que la que proporcionan las técnicas de extracción celular. Un mayor inconveniente de los métodos de lisis directa es que se extrae una mayor cantidad de sustancias inhibidoras del PCR junto con el ADN.
Cada protocolo empleahabitualmente de uno a los tres elementos básicos siguientes: disrupción física, lisis química y lisis enzimática.
Se han descrito cuatro técnicas diferentes de disrupción física: hielo-deshielo, homogeneización en molino de bolas, ultrasonidos, y molienda en nitrógeno líquido. La homogeneización en molino de bolas proporciona mayor cantidad de ADN.
Los procedimientos de lisis químicautilizados varían, pero sus mezclas de lisis pueden catalogarse entre las mezclas que contienen detergente (SDS, NaCl y Tris o fosfato pH 7 o 8). Las modificaciones de las técnicas básicas de lisis químicas incluyen altas temperaturas, incubación, una etapa de extracción con fenol o cloroformo, y la incorporación de agentes quelantes (EDTA y Chelex 100).
Lisis enzimática: Lisozima, proteinasa K,acromopeptidasa y pronasa E han sido empleadas para promover la lisis celular, y la digestión de lisozimas es el procedimiento más utilizado.
La eficiencia de la purificación se juzga usualmente por la cantidad de ADN recuperada y el éxito de los métodos empleados para eliminar contaminantes que inhiben las enzimas PCR y otras enzimas requeridas para análisis moleculares.
La selección de unprocedimiento adecuado de extracción y purificación de ADN entre los procedimientos descritos hasta la fecha, se convierte en un gran problema en la aplicación de las técnicas moleculares a los estudios sobre las comunidades microbianas de los suelos y sedimentos.
Los objetivos de este estudio fueron la comparación de los elementos más comunes de los protocolos de extracción y purificación de ADN yel uso de la información obtenida para desarrollar un método global para obtener ADN de comunidades completas a partir de muestras de suelo y sedimento que contengan diferentes cantidades de materia orgánica. Se ha evaluado nueve procedimientos distintos, contrastando elementos físicos, químicos y enzimáticos, sobre la base de criterios: (1) eficacia de la lisis celular, (2) rendimiento total de...
Comparamos y evaluamos estadísticamente la eficacia de nueve procedimientos de extracción de ADN utilizando dos muestras congeladas y secas de sedimento de suelo de marga y una de sedimento de suelo de marga de humedal con diferente contenido de materia orgánica.Comparaciones por parejas de los nueve procedimientos de extracción, revelaron que la homogeneización en “molino de bolas”, con SDS combinado, bien con cloroformo, bien con fenol, optimizaba tanto la cantidad de ADN extraído como el tamaño molecular del ADN (máximo, de 16 a 20kb). Ni la digestión de lisozimas antes del tratamiento con SDS, ni el tratamiento con isotiocianato de guanadinio, ni la adición deresina de Chelex 100 mejoraron los rendimientos de ADN.
Evaluamos cuatro métodos distintos de purificación de ADN (“unión silícea de ADN”, electroforesis en gel de agarosa, precipitado de acetato amónico, y filtrado en gel Sephadex G-200) para la recuperación de ADN y la eliminación de inhibidores de PCR de extractos crudos (en bruto). La purificación Sephadex G-200 resultó ser el mejor métodopara eliminar sustancias inhibidoras del PCR, minimizando la perdida de ADN durante la purificación. Para este tipo de muestras, la recuperación óptima de ADN requiere homogeneización breve, y a baja velocidad, en “molino de bolas”, en presencia de una mezcla de SDS y cloroformo, con “amortiguador de fosfato, seguida de una columna centrifugadora de Sephadex G-200.
Las técnicas de lisisdirecta, han sido utilizadas en mayor medida porque obtienen mayor cantidad de ADN, y presumiblemente, una muestra menos parcial de la diversidad de la comunidad microbiana que la que proporcionan las técnicas de extracción celular. Un mayor inconveniente de los métodos de lisis directa es que se extrae una mayor cantidad de sustancias inhibidoras del PCR junto con el ADN.
Cada protocolo empleahabitualmente de uno a los tres elementos básicos siguientes: disrupción física, lisis química y lisis enzimática.
Se han descrito cuatro técnicas diferentes de disrupción física: hielo-deshielo, homogeneización en molino de bolas, ultrasonidos, y molienda en nitrógeno líquido. La homogeneización en molino de bolas proporciona mayor cantidad de ADN.
Los procedimientos de lisis químicautilizados varían, pero sus mezclas de lisis pueden catalogarse entre las mezclas que contienen detergente (SDS, NaCl y Tris o fosfato pH 7 o 8). Las modificaciones de las técnicas básicas de lisis químicas incluyen altas temperaturas, incubación, una etapa de extracción con fenol o cloroformo, y la incorporación de agentes quelantes (EDTA y Chelex 100).
Lisis enzimática: Lisozima, proteinasa K,acromopeptidasa y pronasa E han sido empleadas para promover la lisis celular, y la digestión de lisozimas es el procedimiento más utilizado.
La eficiencia de la purificación se juzga usualmente por la cantidad de ADN recuperada y el éxito de los métodos empleados para eliminar contaminantes que inhiben las enzimas PCR y otras enzimas requeridas para análisis moleculares.
La selección de unprocedimiento adecuado de extracción y purificación de ADN entre los procedimientos descritos hasta la fecha, se convierte en un gran problema en la aplicación de las técnicas moleculares a los estudios sobre las comunidades microbianas de los suelos y sedimentos.
Los objetivos de este estudio fueron la comparación de los elementos más comunes de los protocolos de extracción y purificación de ADN yel uso de la información obtenida para desarrollar un método global para obtener ADN de comunidades completas a partir de muestras de suelo y sedimento que contengan diferentes cantidades de materia orgánica. Se ha evaluado nueve procedimientos distintos, contrastando elementos físicos, químicos y enzimáticos, sobre la base de criterios: (1) eficacia de la lisis celular, (2) rendimiento total de...
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