Evaluación De La Calidad Y Cantidad De Ácidos Nucleicos

Evaluación de la calidad y cantidad de ácidos nucleicos a partir de extractos de ADN y ARN de osteíctios
Rodríguez Castillo, Emanuel
Resumen:
La extracción y purificación de ácidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayoría de los estudios en biología molecular y de todas las técnicas de recombinación de ADN. Los métodos de extracción nos permiten obtener ácidos nucleicos purificadosa partir de diversas fuentes para después realizar análisis específicos de cuantificación, calidad entre otros. Se hicieron dos estudios de evaluación, el primero para ADN donde se usaron 3 tipos de muestras: pejerrey fresco y fijado y enlatado de caballa y el segundo para ARN con el uso de tilapia la cual estuvo expuesta a dieta variable. Una previa extracción a base de separadores químicos yfísicos y una posterior medición por espectrometría nos permitió determinar la cantidad de g por gramos de tejido en cada caso, un análisis electroforético en gel de agarosa nos permitió comprobar la calidad de nuestra muestra y de los protocolos usados en cada caso.
Key Words: extracción DNA, RNA, muestras enlatadas, muestras frescas buffer CTAB
Materiales y Métodos:
Para extraer los ácidosnucleicos del material biológico es preciso provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los ácidos nucleicos de los restos celulares. En nuestro caso se realizaron 2 experiencias cuantificación y cualificación de ácidos nucleicos, la primera era para cuantificar y cualificar DNA a partir de 3 muestras diferentes siendo estas pejerrey fresco, pejerrey fijado en alcohol70o y conserva de caballa; en la cual se obtuvieron pequeñas porciones de tejido (30~50 mg) que fueron pesados, separados en tubos autoclavados y rotuladas (ver Anexo). Posteriormente se agregó 300 L CTAB, se disgrego mecánicamente por trituración y se incubo por 30 min a 60 oC. Luego se adiciona 600 L de un solvente orgánico cloroformo: alcohol isoamilico en proporción 24:1 invirtiendo el tubovarias veces por 5min. Centrifugar en frio (4o C) a 10000 RPMx 5min. Luego se retiró 400L de la fase superior y colocarlo en un tubo conteniendo 30L acetato de sodio: 600L etanol absoluto frio, homogenizar y reposara temperatura ambiente x30min. Centrifugar en frio a 10000 RPMx20min.
Decantar el sobrenadante y al precipitado (DNA) lavar con 500L de etanol absoluto frio y centrifugar en frio a10000 RPMx 2min. Se retira el etanol y se deja secar el pellet para luego resuspenderlo con 100L de buffer TE y almacenarlo a 70oC.
En la segunda experiencia, se usó RNA de tilapia, la cual ha estado sometida a una dieta de 3 tipos de alimento, del cual se obtuvieron porciones de tejido de aproximadamente 50mg a los cuales fueron pesados, separadas en tubos autoclavados conteniendo Trizol yrotuladas (ver Anexo). Después se disgrego mecánicamente e incubó a temperatura ambiente por 10min. Se le añadió 200L de cloroformo, se agito por inversión y se dejó reposar por 5min. Centrifugar en frio a 10000 RPM x 15min. Luego se tomó 200L de la fase acuosa y transfirió a un tubo con 500 L de alcohol isopropílico donde se homogenizó por inversión y se dejó reposar x 10min. Centrifugar a 10000RPM x10 min.
Se retiró el sobrenadante y el lavado se hizo con 1 mL de etanol 80o y se centrifugo a 10000 RPM x5min. La resuspension del pellet es similar a con DNA con la diferencia que se usó agua bidestilada.
Se procesaron 24 tubos para DNA y 23 tubos para RNA, de los cuales se procedió a cuantificar la cantidad de ácidos nucleicos por medio de análisis espectrofotométrico en unespectrofotómetro UNICO-2100UV tomando datos de Absorbancia 230nm, 260nm y 280nm para determinar la pureza de la muestra y su posible contaminación. La evaluación de calidad e integridad del proceso de extracción tanto de RNA como DNA se hizo mediante una electroforesis horizontal en gel de agarosa al 1% en una cámara electroforética conteniendo buffer de carga (glicerol y azul de bromofenol y cinanocenol)...