Exclusion molecula por cromatografia

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

INGENIERÍA BIOQUÍMICA

ASIGNATURA: METODOS DE ANALISIS

PRACTICA:
separacion de grupos usando cromatografia por exclusion.

ALUMNO: CEJA GONZALEZ CARLOS ALEJANDRO
SECCION: 2
GRUPO: IB4A

Objetivos.

El alumno:

a) Determinará algunos parámetros que caracterizan al lecho cromatogràfico.

b)Efectuará la desalación de la albúmina, utilizando la técnica de cromatografía por exclusión.

Datos experimentales e informe.

1.- Determinación del volumen vacío (Vo) de la columna.

Tabla 1. Determinación del volumen vacío (Vo) de la columna.

Volumen de elución(mL) | A615 |
3 | 0 |
6 | -0.005 |
9 | -0.007 |
12 | -0.008 |
15 | -0.008 |
18 | -0.007 |
21 | -0.008 |
24 | 0.15|
27 | 1.091 |
30 | 0.547 |
33 | 0.027 |
36 | -0.002 |
39 | -0.006 |

a) Gráfica.

* Parámetros que caracterizan el lecho cromatogràfico.

b) ¿Cuál es el volumen total de la columna (VT)?

VT=π r2 h

Datos:
r = 0.9 cm
r2 = 0.81 cm
h = 26.5 cm

VT = π(0.9)2 (29cm)

VT = 73.69cm2
VT = 67.4343 mL

c) ¿Cuál fue el volumen vacio (V0) de la columna y quéimportancia tiene determinarlo?
Lo determinamos en base al volumen (mL) que tuvo la mayor absorbancia a 615 nm en el perfil de elución de la dextrana azul 2000.

V0 = 27 mL

d) Determine el volumen que ocupa en la columna el líquido que se encuentra en el interior de la estructura del gel (Vi) y el volumen del gel solo (Vg).

Vi = g w
Consideraciones.

g = Gramos de gel seco
w = Agua necesariapara hinchar 1g de gel seco
1g de gel seco ---------- requiere 2.5 ( 2) mL regulador para hincharse
1g de gel hinchado ---------- hay 5 mL regulador

1g de gel hinchado ---------- 5mL de regulador
X g ---------- 73.69 mL (volumen total)

Xg = 14.75 g

1g de gel seco ---------- requiere 2.5 mL de regulador para hincharse
13.4869 g ---------- X mL de regulador requiere (volumen interno)X mL = 36.89 mL

Vi = 36.89 mL

Para calcular el volumen del gel consideramos:

VTotal = Vvacio + Vinterno + Vgel

Vgel = VTotal – (Vvacio + Vinterno)

Vgel = (73.69) – ((27 mL) + (36.89 mL))

Vgel = 9.71 mL

2.- Separación del sulfato de amonio de la proteína.

Tabla 2. Separación del sulfato de amonio y la albúmina.

Volumen de elución (mL) | A280 | Masa del tubo vacio(g) |Masa del tubo con precipitado seco (g) | (NH4)2SO4 (mg) |
3 | 0 | 7.5623 | 0 | 0 |
6 | -0.005 | 6.5743 | 0 | 0 |
9 | -0.005 | 8.7255 | 0 | 0 |
12 | -0.009 | 6.3979 | 0 | 0 |
15 | -0.01 | 7.5726 | 0 | 0 |
18 | -0.011 | 7.5112 | 0 | 0 |
21 | 0.008 | 6.1458 | 0 | 0 |
24 | 0.477 | 9.8570 | 0 | 0 |
27 | 0.378 | 8.5720 | 0 | 0 |
30 | 0.056 | 7.8566 | 0 | 0 |
33 | -0.008 | 6.0703 |6.0812 | 10.9 |
36 | -0.014 | 9.8238 | 9.8316 | 7.8 |
39 | -0.004 | 7.7095 | 7.7227 | 13.2 |
42 | -0.001 | 6.5208 | 6.5563 | 35.5 |
45 | -0.023 | 6.5423 | 6.6092 | 66.9 |
48 | -0.032 | 6.3069 | 6.3530 | 46.1 |
51 | -0.035 | 6.0583 | 6.0789 | 20.6 |
54 | -0.034 | 6.1053 | 6.1150 | 9.7 |
57 | -0.035 | 9.8711 | 0 | 0 |
60 | -0.037 | 7.4563 | 0 | 0 |
63 | -0.038 | 6.3526 | 0 | 0 |66 | -0.041 | 6.3325 | 0 | 0 |
69 | -0.042 | 6.2835 | 0 | 0 |
72 | -0.043 | 8.6233 | 0 | 0 |
75 | -0.04 | 6.2371 | 0 | 0 |

a) Gráfica.

b) ¿Qué sustancia eluyò primero y cuál después?

De acuerdo al perfil de elución podemos observar que la sustancia que eluyò primero fue la albumina (proteína), debido a que de acuerdo al fundamento de esta técnica, podemos darnos cuenta quela albumina es de mayor tamaño (P.M. = 69 KDa) que el tamaño del poro del gel por lo tanto fue excluida primero, a diferencia del sulfato de amonio que es de menor tamaño, siendo retardado al entrar a la red tridimensional de las esferas de gel.

c) ¿Qué es un gel y qué características debe tener un gel cromatogràficamente útil?

Un gel es un polímero en forma de red tridimensional,...