Exclusion

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

MÉTODOS DE ANÁLISIS

Separación de grupos usando cromatografía por exclusión

4IM1

López Razo Arturo Alejandro

Prof. Dalila

INTRODUCCION
Es una de las técnicas más sencillas de las empleadas en la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Este tipo de cromatografía serealiza en columnas cilíndricas rellenas con algunos de los geles que se fabrican con este fin y que pueden ser de varios tipos:
dextranos con enlaces cruzados (sephadex), agarosa (sepharose, Bio-gel A), poliacrilamida (Bio-gel B), etc. Todos estos geles (fase estacionaria) se hallan constituidos por gránulos (partículas) de un material esponjoso hidratado, que contiene poros con un tamaño dediámetro determinado.
Cuando se hace pasar una mezcla de moléculas de distinto tamaño, a través de una columna de filtración en gel; aquellas moléculas con un tamaño mayor que el diámetro de los poros de las partículas, sólo podrán moverse en su camino, a través de la fase estacionaria, en el espacio que queda entre las partículas; y por lo tanto, no se verán retrasadas en su descenso. En cambioaquellas moléculas capaces de penetrar en las partículas se verán retrasadas por la fase estacionaria; en mayor medida, cuanto menor sea su tamaño. Por lo tanto, las moléculas eluyen en este tipo de cromatografía por orden decreciente de tamaño molecular.
Las mallas del gel permiten la entrada selectiva de las partículas de menor masa molecular. De ahí que las partículas de mayor peso molecular salganprimero.

OBJETIVOS
* Determinar algunos parámetros que caracterizan el lecho cromatográfico
* Efectuar la desalación de la albumina, utilizando la técnica de cromatografía por exclusión.

RESULTADOS
tubo | volumen de | A615 |
  | elución (ml) |   |
1 | 3 | 0.008 |
2 | 6 | -0.001 |
3 | 9 | 0.001 |
4 | 12 | 0.004 |
5 | 15 | 0.25 |
6 | 18 | 0.278 |
7 | 21 | 0.128 |
8| 24 | 0.029 |
9 | 27 | 0.008 |
10 | 30 | 0.003 |
11 | 33 | -0.002 |
12 | 36 | -0.003 |
13 | 39 | -0.001 |
14 | 42 | 0 |
15 | 45 | 0 |

¿Cuál fue el volumen total de la columna?
Diámetro interno 1.9 cm y una altura de 17 cm.
Radio de 0.95 cm
VT=πr2l=π0.95217=48.19cm3
¿Cuál fue el volumen vacío de la columna?
Fue de 18 ml
¿Qué importancia tiene determinarlo?
Sirve parapoder calcular el volumen que ocupa el gel seco y sirve para saber cuánto volumen hay en total entre cada espacio vacío por donde pasa la sustancia excluida.
1g de gel seco -------5 ml de volumen hidratado
X g de gel seco-------48.19 ml de volumen total hidratado
X= 9.638 g de gel seco

1g de gel seco -------2.5 ml de agua retenida
9.638g de gel seco------- x ml de agua retenida
X= 24.095 ml =Vi
VT= Vo+Vg+Vi ∴ Vg=VT-Vo-Vg
Vg=48.19 ml-18 ml-24.095 ml=6.095 ml
VT = 48.19 ml
Vo = 18 ml
Vg = 6.095 ml
Vi = 24.095 ml

tubo | volumen de | A280 | masa del tubo | masa del tubo | (NH4)2S04 |
  | elución (ml) |   | vacío (g) | con pp seco (g) | (mg) |
1 | 3 | 0 | 5.1509 | -- | -- |
2 | 6 | -0.003 | 5.2378 | -- | -- |
3 | 9 | -0.002 | 6.3768 | -- | -- |
4 | 12 | -0.004 |5.2413 | -- | -- |
5 | 15 | 0.021 | 6.6253 | -- | -- |
6 | 18 | 0.799 | 6.4272 | -- | -- |
7 | 21 | 0.257 | 6.1536 | -- | -- |
8 | 24 | 0.058 | 7.5123 | -- | -- |
9 | 27 | 0.027 | 6.6807 | 6.6949 | 14.2 |
10 | 30 | 0.017 | 6.3948 | 6.4343 | 39.5 |
11 | 33 | 0.001 | 5.2 | 5.2643 | 64.3 |
12 | 36 | -0.004 | 5.1964 | 5.2212 | 24.8 |
13 | 39 | -0.005 | 5.2817 | 5.2949 | 13.2 |
14 |42 | -0.002 | 5.2209 | 5.2245 | 3.6 |
15 | 45 | -0.006 | 6.4912 | -- | -- |
16 | 48 | -0.008 | 8.7218 | -- | -- |
17 | 51 | -0.012 | 5.2246 | -- | -- |
18 | 54 | -0.012 | 6.1891 | -- | -- |
19 | 57 | -0.011 | 6.5872 | -- | -- |
20 | 60 | -0.013 | 5.1688 | -- | -- |
21 | 63 | -0.014 | 5.1964 | -- | -- |
22 | 66 | -0.014 | 6.1796 | -- | -- |
23 | 69 | -0.014 | 8.5301 | -- | -- |...