Experimentación En Biología Celular

INTRODUCCIÓN A LA EXPERIMENTACIÓN EN BIOLOGÍA CELULAR CUADERNO DE PRÁCTICAS

Josué Otero Arenas

PRÁCTICA Nº1 : INCLUSIÓN EN PARAFINA DE PIEZAS VEGETALES Y ANIMALES. INTRODUCCIÓN: El objetivo de esta práctica es la familiarización con la técnica de inclusión en parafina de piezas animales y vegetales. Esta técnica tiene como fundamento el endurecimiento de piezas que se quieran observar almicroscopio óptico, este endurecimiento permite que se puedan obtener cortes de esas muestras lo suficientemente finos para poder ser observados al microscopio óptico. Las piezas que se van a incluir son : – Cabeza de embrión de pollo. – Trozo de hoja de especie sin identificar. MATERIALES -Lupa -Placa de Petri. -2 Tubos de ensayo de cristal con tapón. -Pinzas. -Pipetas Pasteur de plástico.-Cronómetro. -Campana de gases. -Estufa de laboratorio. -Frigorífico. -Molde de plástico. -PBS. -Etanol (100%, 90%, 70%, 50%, 30%) -Paraformaldehido. -Xilol. -Parafina. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA: Antes de comenzar con el proceso de inclusión en parafina se estadifica el embrión (colocado en una placa con PBS 0,1M a PH 7,41) observándolo con la lupa y utilizando las tablas de estadificación de Hamburger yHamilton. Se observan las siguientes estructuras : Miembros: Están claramente marcados los tres segmentos de los miembros, tanto superiores como inferiores(1y3). Las alas se incurvan en la articulación del codo y las piernas en la articulación de la rodilla. Se observan surcos entre todos los dedos del ala y de los pies. Arcos viscerales: El proceso mandibular (12) se aproxima al pico, aunque laseparación entre los dos es todavía visible. El alargamiento del cuello es muy marcado.

Estadío HH30 [1—extremidad inferior;2—sistema digestivo; 3—extremidad superior; Diamante: Se distingue como una ligera protuberancia 4—corazón; 5—pico; 6—diamante; (6). El pico es más prominente que en estadios anteriores. 7—telencéfalo;8—ojo; 9-diencéfalo; 10—metencéfalo; 11—mielencéfalo; 12—procesomandibular; 13—columna vertebral] 1 Es la molaridad y el PH estándar del medio interno de las muestras in vivo.

Aunque no se han podido observar esbozos de plumas en la región dorsal y en las extremidades inferiores. La aparición del diamante ayuda a estadificar el embrión en un estadío HH 30. La estadificación del embrión es una información importante a la hora de estudiarlo. Ya que es una valiosareferencia a la hora de saber qué estructuras son las que normalmente tiene que presentar cuando observamos cortes al microscopio.

Una vez estadificado el embrión, se corta la cabeza del embrión con ayuda de unas pinzas y se inicia el proceso de inclusión en parafina. El procedimiento se divide en 7 pasos básicos2 : 1. Fijación: Es la etapa más importante del proceso (los errores cometidos no sepueden corregir y pueden producir artefactos). El objetivo de esta fase es conservar la estructura de las células y los tejidos de la muestra con el mínimo de alteraciones con respecto al estado vivo. En este caso se ha realizado una fijación química por inmersión. Introduciendo la muestra en un tubo de cristal3 y añadiéndole (como mínimo un volumen 10 veces superior al de la muestra4)paraformaldehido al 4% (diluido en PBS 0,1M PH 7,4) . El tubo se tapa y la muestra pasará en el fijador aproximadamente 24 horas a 4ºC5. 2. Lavado: Tras la fijación se somete la muestra a 2 baños de 20 minutos cada uno en PBS 0,1M a PH 7,4. Con estos baños se eliminan los restos de fijador y paramos el proceso de fijación, evitando una pérdida excesiva del volumen de la muestra. 3. Deshidratación: En estafase se eliminan los restos de agua del tejido de la muestra, del fijador y los lavados. Esto se hace porque la parafina no es soluble en agua y, por tanto, no podría impregnar la muestra por completo. Se lleva a cabo dando baños a la muestra en concentraciones crecientes de etanol a temperatura ambiente tal y como indica el esquema : Etanol 30%(30min)→etanol 50% (30min) → etanol 50% (30min) →...