Experimental Maltose

Universidade de São Paulo
Faculdade de Ciências Farmacêuticas





Relatório Práticas 7 e 8.



Disciplina: QBQ 0316 – Bioquímica Experimental / Prof. Fabio Luis Forti e Ricardo J. Giordano
São Paulo, 19 de Novembro de 2012.

Relatório da Prática 7

Caracterização da alfa-glicosidase: Km e Vmax
Objetivo: Caracterizar a α-glicosidase de Saccharomyces cerevisiae através dasdeterminações da afinidade (Km) da enzima pelo substrato (p-nitrofenol-α-glicosídeo) e da velocidade máxima (Vmax) de hidrólise do substrato.
1.1. Procedimentos A e B:
Preparados os tubos contendo os volumes de NPαGlc, tampão e lisado estipulados na tabela 1 em banho de gelo, devidamente incubados em banho a 30ºC por 40min. E posteriormente lidas as absorbâncias por espectrofotometria em leitorde placas ajustado a 405nm.

Gráfico 1. Curva padrão do p-nitrofenolato no leitor de placas ajustado a 405nm.

1.2. Resultados:

Para obter o número de mols de produto substituímos as absorbâncias obtidas por espectrofotometria na equação de reta da curva padrão do p-nitrofenolato no leitor de placas, expressada pela equação: y = 0,0049x + 0,014. A partir dos valores obtidospudemos calcular a velocidade das reações pela razão entre numero de mols de produto e tempo de reação. Os valores obtidos estão apresentados na tabela a seguir:
Tabela 2 – Para cálculo de VMax e KMax.
Tubos | [S] (no tubo de ensaio mM) | A405 | nmols de produto | Tempo da reação(min) | Velocidade(nmol/min) |
1 | 0,05 | 0,184 | 34,69388 | 40 | 0,867347 |
2 | 0,10 | 0,336 | 65,71429 | 40 |1,642857 |
3 | 0,20 | 0,569 | 113,2653 | 40 | 2,831633 |
4 | 0,30 | 0,688 | 137,5510 | 40 | 3,438776 |
5 | 0,40 | 0,864 | 173,4694 | 40 | 4,336735 |
6 | 0,50 | 1,677 | 339,3878 | 40 | 8,484694 |
7 | 0,80 | 1,965 | 398,1633 | 40 | 9,954082 |
8 | 1,00 | 2,258 | 457,9592 | 40 | 11,44898 |
9 | 2,00 | 2,549 | 517,3469 | 40 | 12,93367 |
10 | 2,60 | 2,559 | 519,3878 | 40 | 12,98469 |
11 |3,00 | 2,563 | 520,2041 | 40 | 13,00510 |

1.3.Gráficos:

1.3.1. Gráfico Michaelis-Menten:
Tabela 3
[S](mM) | Velocidade(nmol/min) |
0,05 | 0,867347 |
0,10 | 1,642857 |
0,20 | 2,831633 |
0,30 | 3,438776 |
0,40 | 4,336735 |
0,50 | 8,484694 |
0,80 | 9,954082 |
1,00 | 11,44898 |
2,00 | 12,93367 |
2,60 | 12,98469 |
3,00 | 13,00510 |
Gráfico 2. Correlação entre avelocidade inicial de reação enzimática e a concentração de substrato utilizado (Michaelis-Menten).



*Os desvios apresentados no gráfico 2 podem ser explicados por erros de pipetagem ou calibração do aparelho utilizado.

1.3.2. Transformação de Lineweaver-Burk:
Tabela 41/[S](mM)-1 | 1/Velocidade(nmol/min)-1 |
20 | 1,152941 |
10 | 0,608696 |
5 | 0,353153 |
3,333333 | 0,290801 |
2,5 | 0,230588 |
2 | 0,117859 |
1,25 | 0,100461 |
1 | 0,087344 |
0,5 | 0,077318 |
0,384615 | 0,077014 |
0,333333 | 0,076893 |
Gráfico 3. Transformação de Lineweaver-Burk para o experimento.

1.4.Determinação de Km e Vmax:
y = ax + b.
que é uma equação de reta do tipoA transformação de Lineweaver-Burk compõe uma reta que se extrapolada, permite a determinação dos valores de Km e Velocidade máxima. Para determinar os valores de Km e Velocidade máxima, devemos estabelecer os valores de intersecção da reta com o eixo x e o eixo y, respectivamente, utilizando a equação de reta obtida pelos dados experimentais
y = 0,0554x + 0,0552
A reta apresentacorrespondência com o inverso da equação de Michaelis-Menten:
1Vo = KmVmax ∙ 1[S]+ 1Vmax

Figura 1. Representação da transformação de Lineweaver-Burk
..

1.4.1. Determinação de Km:
Considerando que -1Km corresponde ao valor de intersecção da reta com o eixo x, e que pela transformação de de Lineweaver-Burk obtivemos a equação de reta y = 0,0554x + 0,0552, temos:
0 = 0,0544 . -1Km+ 0,0552 →...