Extracción, cuantificación y electroforésis de ADN

MATERIAL Y REACTIVOS
1. Nitrógeno
2. Mortero
3. Termo block/termómetro
4. DNAzol
5. Tubos 1.5 ml
6. Puntas azules, amarillas y blancas
7. Pipetas 1ml, 200 µl, 20 µl
8. Cloroformo
9. Timer10. Cámara de Electroforésis
11. Gradilla
12. Matráz Erlenmeyer.
13. Tubos de 600 µl




1. Marcador
2. Centrifuga tubos 1.5 ml refrigerada
3. Hielo
4. Etanol absoluto frio
5. Vortex
6.Etanol 70%
7. Agua libre de nucleasas
8. Gradilla para tubos 1.5 ml
9. Buffer TAE 1X.
10. Timer.
11. Loading Buffer.
12. Texas Red.




METODO
PARTE 1) EXTRACCION DE ADN
Previamente:
1.Disectar un fragmento de tejido (piel de ratón Silvestre y Transgénico).
2. Triturar la muestra en un mortero utilizando nitrógeno líquido.
3. Adicionar 300 µl de Buffer de lisis.
4. Adicionar 1µl de PK he incubar a 50ºC toda la noche.

Una vez hecho esto:
1. Agregar 300 µl de DNAzol/mezclar.
2. Dejar reposar 7 min con agitación a temperatura ambiente (con agitación ocasional).
3.Agregar 300 µl de cloroformo.
4. Mezclar y dejar reposar 7 min a temperatura ambiente.
5. Centrifugar 13,000 rpm/10 min/4 °C.
6. Etiquetar un tubo nuevo y pasar el sobrenadante al tubo limpio.
7.Precipitar con Etanol absoluto frio (500 µl) y mezclar.
8. Dejar reposar (10 min) /4 °C.
9. Centrifugar 9,000 rpm/5min/ 4 °C.
10. Decantar y mantener el botón.
11. Lavar con 300 µl, solución: 600 µlDNAzol + 450µl Etanol absoluto.
12. Resuspender ligeramente.
13. Dejar reposar 5 min.
14. Centrifugar 8000 rpm/15 min/4 °C.
15. Decantar.
16. Lavar la pastilla con 300 µl de Etanol 70%.17. Centrifugar 9,000 rpm/ 7 min/4 °C.
18. Decantar.
19. Dejar secar
20. Resuspender en 20-30 µl de agua estéril.
21. Calentar a 65 °C/ 20 min (termo-block)
22. Pasar a hielo inmediatamente(mantener durante 3-5 min)
23. Cuantificar y ver en gel de agarosa al 0.7%

PARTE 2) CUANTIFICACION
5. Homogenizar el DNA extraído en la práctica anterior.
6. Preparar una dilución 1:100 con agua...