Extracción de adn de muestras en parafina

EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE MATERIAL EN PARAFINA

ÍNDICE

1. OBJETO
2. CAMPO DE APLICACIÓN
3. DEFINICIONES Y ABREVIATURAS
4. DESCRIPCIÓN DEL PROCESO
5. RESPONSABILIDADES
6. DOCUMENTACIÓN
7. REGISTROS
8. DOCUMENTOS DE REFERENCIA
9. ANEXOS

1. OBJETO

El objeto de este procedimiento es definir el protocolo a seguir para la obtención de ADN a partirde 1-2 cortes (grosor 5-10 µm) de tejido en parafina con el kit QIAamp® Mini de Qiagen de acuerdo a los criterios de aceptación definidos. Hace referencia a los puntos 5.2, 7.1, 7.2 y 7.5 de la Norma ISO 9001:2008.

2. CAMPO DE APLICACIÓN

* Este procedimiento se aplica a todas las muestras de cortes de tejido en parafina de las que se solicita extracción de ADN y se realiza en el BiobancoLa Fe.

3. DEFINICIONES Y ABREVIATURAS

ADN: Ácido Desoxirribonucleico. Es un polímero lineal de nucleótidos formando una larga cadena de nucleótidos compuestos por grupos fosfato y azúcares, que en el caso del DNA es la desoxiribosa y sus bases nitrogenadas pueden ser de tipo pirimidina, citosina y timina o de tipo purina, adenina y guanina. La función principal del DNA es conservar lainformación genética.
Este Procedimiento Específico deriva del PG_3. Asimismo, deriva del PE_X (control de la calidad del ADN).

Se especifican las siguientes abreviaturas:

* SC: Sistema de Calidad.
* SGI: Sistema de Gestión de la Información.
* DB: Director Científico de Biobanco.
* RC: Responsable de Calidad.
* RL: Responsable de Laboratorio.
* PG: Procedimiento General.* PE: Procedimiento Específico.
* IT: Instrucción Técnica.
* ADN: Ácido Desoxirribonucleico.
* RC: Registro.

4. EQUIPOS Y REACTIVOS NECESARIOS

4.1 MATERIAL

4.1.1. EQUIPOS
* Microcentrifugadora de mesa para tubos cónicos de 1,5 ml.
* Cabina de seguridad biológica clase-II-A.
* Agitador vortex.
* Pipeta automática de 1000 µl.
* Pipeta automática de 100µl.
* Pipeta automática de 10 µl.
* Baño con regulador de temperatura o termobloque seco.
* Espectrofotómetro Nanodrop.
4.1.2. REACTIVOS
* Kit de extracción de DNA, QUIamp® DNA Mini Qiagen.
* Etanol absoluto. (No usar alcohol desnaturalizado ya que contiene otras sustancias como metanol o metiletilcetona.)
* Xileno.
* Tampón TE.
4.1.3 MATERIAL FUNGIBLE
*Puntas de pipetas automáticas con filtro de 1000 µl.
* Puntas de pipetas automáticas con filtro de 100 µl.
* Puntas de pipetas automáticas con filtro de 10 µl.
* Gradilla para tubos de 1,5 ml.
* Tubos estériles de 1,5 ml.
* Rotulador indeleble de punta fina.

5. DESCRIPCIÓN DEL PROCESO

DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO:

4.2 PROCEDIMIENTO
Antes de empezar conviene tener encuenta:
* Todos los pasos de centrifugación se llevan a cabo a temperatura ambiente (15-25ºC), siendo lo óptimo para el DNA, 18ºC.
* El tiempo de lisis puede variar según el tipo de tejido procesado de partida.
* No olvidar rotular los tubos de las distintas muestras en cada uno de los pasos para no perder la trazabilidad. Además conviene recordar que los reactivos usados en losdistintos pasos pueden borrar la identificación y por ello se recomienda comprobar que las muestras están identificadas en todo momento.
Cosas a preparar antes de comenzar:
* Calentar un baño de agua o un termobloque a 70º C.
* Calentar un baño de agua o un termobloque a 56º C para el paso 3 del procedimiento.
* Equilibrar el tampón TE (con concentración de EDTA reducida) o agua destiladaa temperatura ambiente para la elución que se llevará a cabo en el paso 10.
* Asegurarse que los tampones AW1, AW2 y la proteinasa K de Qiagen se han preparado según las instrucciones del kit (IT_X, instrucciones para el uso del kit QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook (ref. 51304).
* Si se forma un precipitado en el tampon AL, disolverlo incubando a 56º C aunquen este precipitado...