Extracción De Adn Genomico

Extracción de plásmidos

Preparación de ADN plasmídico

Método

Muchos métodos diferentes están disponibles para el aislamiento de ADN plasmídico. En esta práctica se quiere estar utilizando unkit disponible comercialmente, que utiliza una columna de afinidad para purificar el ADN plasmídico. Las bacterias que contienen el plásmido se cultiva a partir de una sola colonia en un medioadecuado tal como caldo Luria (LB). Una parte alícuota del cultivo se usa para preparar el ADN plasmídico.

Principio

ReactivoCentrifugaciónEl cultivo bacterianoSolución I(PH 8,0 Tris)EDTA-etilenodiamino tetra ácido acético yGlucosa)RNasaLa lisozima - opcionalSolución IIHidróxido de sodioSDS-dodecilsulfato de sodio(PH alcalino `12,0)Solución IIISódico o acetato de potasio(PH ácido5,4)CentrifugaciónHaga girar la columnaSílice membranaElución | Principio * Los resultados de centrifugación en la granulación de las células bacterianas * La glucosa da choque osmótico que conduce a la roturade la pared celular y la membrana * EDTA, inhibe nucleasas * RNasa: Degrada ARN * La lisozima se utiliza para romper la pared celular de las bacterias * La Lisis de la célula completamente *El PH alcalino desnaturaliza ADN cromosómico, pero no el covalentemente cerrado ADN plasmídico circular * Neutraliza el pH alcalino * Precipita proteínas forma una compleja SDS-proteína * ElADN cromosómica se re-naturaliza y completa con proteína * Embola la proteína - ADN se completa * Los plásmidos estarán presente en el sobrenadante (Estos plásmidos se pueden precipitar con etanol -Este solía ser el método convencional). * La membrana sílice se une al ADN plasmídico en condición de separación alta en sal. * Bajo condiciones baja en sal (agua destilada), los plásmidos puedeser eludidos de la membrana sílice |

Protocolo

Cada grupo está provisto con 10 ml de una E. coli (conteniendo el plásmido) cultivo que se ha cultivado durante la noche a 37°C.

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