Extracción De Dna De Sangre Total
Páginas: 5 (1094 palabras)
Publicado: 10 de marzo de 2013
PRACTICA No. 1
Extracción de DNA de sangre total
Objetivos:
-Aprender la metodología utilizada para la extracción de DNA en sangre total.
-Enriquecer los contenidos teóricos estudiados en clase acerca de la estructura del DNA y vincularlos con el laboratorio.
-Denotar los diferentes métodos disponibles para la extracción del DNA.
-Promover el interés por conocer algunos aspectosde aplicaciones clínicas y saber qué técnicas nos ofrecen mejor rendimiento.
-Obtener DNA con un máximo grado de pureza, basado en la buena aplicación del método.
Fundamento:
La molécula de DNA está constituida por dos largas cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. Las dos cadenas de nucleótidos que constituyen una molécula de DNA se mantienen unidas entre síporque se forman enlaces entre las bases nitrogenadas de ambas cadenas que quedan enfrentadas.
La unión de las bases se realiza mediante puentes de hidrógeno, y este apareamiento está condicionado químicamente de forma que la adenina (A) sólo se puede unir con la Timina (T) y la Guanina (G) con la Citosina (C). El orden en el que aparean las cuatro bases a lo largo de una cadena en el ADN es,por tanto, crítico para la célula, ya que este orden es el que constituye las instrucciones del programa genético de los organismos.
La estructura en doble hélice del ADN, con el apareamiento de bases limitado ( A-T; G-C ), implica que el orden o secuencia de bases de una de las cadenas delimita automáticamente el orden de la otra, por eso se dice que las cadenas son complementarias. Una vezconocida la secuencia de las bases de una cadena, se deduce inmediatamente la secuencia de bases de la complementaria.
Todas las células, a excepción de las células anucleadas de los eritrocitos maduros en humanos, contienen DNA en sus núcleos celulares. También podemos encontrar DNA dentro de otros compartimentos celulares diferentes al núcleo, como las mitocondrias y los cloroplastos.
Una vez queha sido extraído el DNA, suele ser rápidamente desnaturalizado y por lo tanto se debe tener mucho cuidado en su remoción, aislamiento y purificación con el fin de obtener un producto que conserve la identidad e integridad estructural de la molécula. El estrés o tensión mecánica o físico química, que acompañan los procesos de purificación de las moléculas de DNA deben ser evitadas al máximo y lasnucleasas inhibidas.
Factores como los iones Ca2+ y Mg2+ son importantes para la actividad del las dnasas, debido a que son enzimas dependientes de éstos iones divalentes para su función. Compuestos como el citrato de sodio o el EDTA comúnmente utilizados en las soluciones empleadas para la extracción y purificación del DNA, atrapan estos iones e impiden, de esta forma, la acción de las enzimasque digieren estas moléculas. Con el fin de eliminar en forma definitiva la actividad de las nucleasas, las etapas de remoción de las proteínas deben ser llevadas a cabo tan rápido como sea posible y en frío.
Existen varios métodos para la purificación del DNA. Por ejemplo, con la extracción directamente de sangre completa se pueden utilizar el Kits comerciales que sirve para purificar materialgenético de humanos, células en cultivo, tejidos animales, vegetales, levaduras y bacterias. Para la realización de este y otros métodos se debe seguir las instrucciones del fabricante. Con esta técnica, podemos utilizar posteriormente los análisis de DNA tales como amplificación (PCR), digestión con endonucleasas de restricción, southern blot o Dot blot
Material:
-1 Gradilla para tubos eppendorf- Pipetas automáticas de 1000, 100 y 10 l
- Material para extracción sanguínea
- Tubos de ensayo de 13 x 100
- Tubos eppendorf
- Ultracentrífuga
- Centrífuga para tubo de ensayo
- Baño María
- Papel aluminio
- Servitoallas
- Guantes
- Cubrebocas
Reactivos:
- Reactivo de lisis
- Buffer TE pH 8.0
- SDS al 10%
- Proteinasa K
- NaCl 5 M
- CTAB
- Cloroformo- alcohol...
Extracción de DNA de sangre total
Objetivos:
-Aprender la metodología utilizada para la extracción de DNA en sangre total.
-Enriquecer los contenidos teóricos estudiados en clase acerca de la estructura del DNA y vincularlos con el laboratorio.
-Denotar los diferentes métodos disponibles para la extracción del DNA.
-Promover el interés por conocer algunos aspectosde aplicaciones clínicas y saber qué técnicas nos ofrecen mejor rendimiento.
-Obtener DNA con un máximo grado de pureza, basado en la buena aplicación del método.
Fundamento:
La molécula de DNA está constituida por dos largas cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. Las dos cadenas de nucleótidos que constituyen una molécula de DNA se mantienen unidas entre síporque se forman enlaces entre las bases nitrogenadas de ambas cadenas que quedan enfrentadas.
La unión de las bases se realiza mediante puentes de hidrógeno, y este apareamiento está condicionado químicamente de forma que la adenina (A) sólo se puede unir con la Timina (T) y la Guanina (G) con la Citosina (C). El orden en el que aparean las cuatro bases a lo largo de una cadena en el ADN es,por tanto, crítico para la célula, ya que este orden es el que constituye las instrucciones del programa genético de los organismos.
La estructura en doble hélice del ADN, con el apareamiento de bases limitado ( A-T; G-C ), implica que el orden o secuencia de bases de una de las cadenas delimita automáticamente el orden de la otra, por eso se dice que las cadenas son complementarias. Una vezconocida la secuencia de las bases de una cadena, se deduce inmediatamente la secuencia de bases de la complementaria.
Todas las células, a excepción de las células anucleadas de los eritrocitos maduros en humanos, contienen DNA en sus núcleos celulares. También podemos encontrar DNA dentro de otros compartimentos celulares diferentes al núcleo, como las mitocondrias y los cloroplastos.
Una vez queha sido extraído el DNA, suele ser rápidamente desnaturalizado y por lo tanto se debe tener mucho cuidado en su remoción, aislamiento y purificación con el fin de obtener un producto que conserve la identidad e integridad estructural de la molécula. El estrés o tensión mecánica o físico química, que acompañan los procesos de purificación de las moléculas de DNA deben ser evitadas al máximo y lasnucleasas inhibidas.
Factores como los iones Ca2+ y Mg2+ son importantes para la actividad del las dnasas, debido a que son enzimas dependientes de éstos iones divalentes para su función. Compuestos como el citrato de sodio o el EDTA comúnmente utilizados en las soluciones empleadas para la extracción y purificación del DNA, atrapan estos iones e impiden, de esta forma, la acción de las enzimasque digieren estas moléculas. Con el fin de eliminar en forma definitiva la actividad de las nucleasas, las etapas de remoción de las proteínas deben ser llevadas a cabo tan rápido como sea posible y en frío.
Existen varios métodos para la purificación del DNA. Por ejemplo, con la extracción directamente de sangre completa se pueden utilizar el Kits comerciales que sirve para purificar materialgenético de humanos, células en cultivo, tejidos animales, vegetales, levaduras y bacterias. Para la realización de este y otros métodos se debe seguir las instrucciones del fabricante. Con esta técnica, podemos utilizar posteriormente los análisis de DNA tales como amplificación (PCR), digestión con endonucleasas de restricción, southern blot o Dot blot
Material:
-1 Gradilla para tubos eppendorf- Pipetas automáticas de 1000, 100 y 10 l
- Material para extracción sanguínea
- Tubos de ensayo de 13 x 100
- Tubos eppendorf
- Ultracentrífuga
- Centrífuga para tubo de ensayo
- Baño María
- Papel aluminio
- Servitoallas
- Guantes
- Cubrebocas
Reactivos:
- Reactivo de lisis
- Buffer TE pH 8.0
- SDS al 10%
- Proteinasa K
- NaCl 5 M
- CTAB
- Cloroformo- alcohol...
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