Extracción De Los Plásmidos Pbsk y Pbbm11, Amplificación Del Gen Gst y Catálisis Mediante Enzimas De Restricción Tipo Ii
Páginas: 5 (1120 palabras)
Publicado: 22 de abril de 2011
Extracción de los plásmidos pBSK y pBBM11, amplificación del gen GST y catálisis mediante enzimas de restricción tipo II
La tecnología del ADN recombinante depende, en parte, de la capacidad de cortar y unir segmentos de ADN por secuencias específicas de bases. Utilizando esta metodología, se pueden transferir segmentos particulares de ADN a virus o a bacterias para amplificarlos, aislarlos eidentificarlos. La utilización de esta tecnología ha conseguido importantes avances en la cartografía de genes, en el diagnóstico de enfermedades, en la producción comercial de productos génicos humanos y en la transferencia de genes entre especies diferentes, tanto en plantas como en animales (Klug y col., 1999).
El término de ADN recombinante hace referencia a la creación de nuevascombinaciones de segmentos o de moléculas de ADN, mediante la utilización de técnicas que provienen de la bioquímica de los ácidos nucleicos unidos a metodologías genéticas, que incluyen una serie de pasos: los fragmentos de ADN se generan utilizando endonucleasas de restricción, que reconocen y cortan las moléculas de ADN por secuencias nucleotídicas específicas. Los fragmentos producidos mediante ladigestión con enzimas de restricción se unen a otras moléculas de ADN que sirven de vectores. Los vectores pueden replicarse autónomamente en una célula huésped y facilitan la manipulación de la molécula de ADN recombinante recién creada. La molécula de ADN recombínate, formada por un vector que lleva un segmento de ADN insertado, se transfiere a una célula huésped. Dentro de esta célula, la molécula deADN recombinante se replica, produciendo docenas de copias idénticas. Al replicarse las células huésped, las células descendientes heredan el ADN recombinante, creándose una población de células idénticas, que llevan todas las secuencias clonadas. Los segmentos de ADN clonados pueden recuperarse de las células huésped, purificarse y analizarse (Klug y col., 1999).
En esta investigación seutilizaron enzimas de restricción tipo EcoRI, provenientes de una cepa de Escherichia coli; el cual reconocen secuencias específicas de nucleótidos, de una molécula de ADN de doble cadena (en este caso un plásmido), y cortan el ADN por esa secuencia. Estas secuencias reconocidas por la enzima EcoRI tipo II son palindrómicas, y cortan las cadenas de manera escalonada dentro del sitio de reconocimiento,dejando extremos de cadena sencilla. Estas colas, que tienen secuencias nucleotídicas idénticas, son pegajosas, ya que pueden unirse a colas complementarias de otros fragmentos de ADN mediante puentes de hidrógeno, y por lo tanto formar fragmentos de ADN recombinante. Luego se utiliza la enzima ADN ligasa para unir covalentemente los esqueletos azucar- fosfato de los dos fragmentos (Klug y col.,1999).
Por otra parte los plásmidos fueron los primeros vectores de clonación; son moléculas de ADN de doble cadena extracromosómica que tienen un origen de replicación (Klug y col., 1999). Son fáciles de aislar y purificar, y pueden ser reintroducidos en una bacteria mediante transformación. Con frecuencia contienen genes que codifican resistencia a los antibióticos; estos genes se utilizan paradetectar mediante selección al huésped bacteriano que lo porta (Prescott y col., 2002).
Los plásmidos al utilizarse como vectores de clonación, se les puede insertar un fragmento de ADN sintético como un oligonuclótido, el cual son cortos segmentos de ADN o de ARN con una longitud 2 a 30 nucleótidos. La capacidad de sintetizar oligonucleótidos de ADN de secuencia conocida resultaextraordinariamente útil, ya que pueden sintetizarse sondas de ADN y prepararse fragmentos de ADN para ser utilizados en técnicas moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (Prescott y col., 2002).
Por último cabe explicar que la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), permite la amplificación directa de segmentos de ADN específicos, utilizando ADN polimerasa y cebadores, oligonucleótidos que...
La tecnología del ADN recombinante depende, en parte, de la capacidad de cortar y unir segmentos de ADN por secuencias específicas de bases. Utilizando esta metodología, se pueden transferir segmentos particulares de ADN a virus o a bacterias para amplificarlos, aislarlos eidentificarlos. La utilización de esta tecnología ha conseguido importantes avances en la cartografía de genes, en el diagnóstico de enfermedades, en la producción comercial de productos génicos humanos y en la transferencia de genes entre especies diferentes, tanto en plantas como en animales (Klug y col., 1999).
El término de ADN recombinante hace referencia a la creación de nuevascombinaciones de segmentos o de moléculas de ADN, mediante la utilización de técnicas que provienen de la bioquímica de los ácidos nucleicos unidos a metodologías genéticas, que incluyen una serie de pasos: los fragmentos de ADN se generan utilizando endonucleasas de restricción, que reconocen y cortan las moléculas de ADN por secuencias nucleotídicas específicas. Los fragmentos producidos mediante ladigestión con enzimas de restricción se unen a otras moléculas de ADN que sirven de vectores. Los vectores pueden replicarse autónomamente en una célula huésped y facilitan la manipulación de la molécula de ADN recombinante recién creada. La molécula de ADN recombínate, formada por un vector que lleva un segmento de ADN insertado, se transfiere a una célula huésped. Dentro de esta célula, la molécula deADN recombinante se replica, produciendo docenas de copias idénticas. Al replicarse las células huésped, las células descendientes heredan el ADN recombinante, creándose una población de células idénticas, que llevan todas las secuencias clonadas. Los segmentos de ADN clonados pueden recuperarse de las células huésped, purificarse y analizarse (Klug y col., 1999).
En esta investigación seutilizaron enzimas de restricción tipo EcoRI, provenientes de una cepa de Escherichia coli; el cual reconocen secuencias específicas de nucleótidos, de una molécula de ADN de doble cadena (en este caso un plásmido), y cortan el ADN por esa secuencia. Estas secuencias reconocidas por la enzima EcoRI tipo II son palindrómicas, y cortan las cadenas de manera escalonada dentro del sitio de reconocimiento,dejando extremos de cadena sencilla. Estas colas, que tienen secuencias nucleotídicas idénticas, son pegajosas, ya que pueden unirse a colas complementarias de otros fragmentos de ADN mediante puentes de hidrógeno, y por lo tanto formar fragmentos de ADN recombinante. Luego se utiliza la enzima ADN ligasa para unir covalentemente los esqueletos azucar- fosfato de los dos fragmentos (Klug y col.,1999).
Por otra parte los plásmidos fueron los primeros vectores de clonación; son moléculas de ADN de doble cadena extracromosómica que tienen un origen de replicación (Klug y col., 1999). Son fáciles de aislar y purificar, y pueden ser reintroducidos en una bacteria mediante transformación. Con frecuencia contienen genes que codifican resistencia a los antibióticos; estos genes se utilizan paradetectar mediante selección al huésped bacteriano que lo porta (Prescott y col., 2002).
Los plásmidos al utilizarse como vectores de clonación, se les puede insertar un fragmento de ADN sintético como un oligonuclótido, el cual son cortos segmentos de ADN o de ARN con una longitud 2 a 30 nucleótidos. La capacidad de sintetizar oligonucleótidos de ADN de secuencia conocida resultaextraordinariamente útil, ya que pueden sintetizarse sondas de ADN y prepararse fragmentos de ADN para ser utilizados en técnicas moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (Prescott y col., 2002).
Por último cabe explicar que la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), permite la amplificación directa de segmentos de ADN específicos, utilizando ADN polimerasa y cebadores, oligonucleótidos que...
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