Extracción de Pigmentos Fotosinteticos

PRÁCTICAS DE FISIOLOGÍA VEGETAL
EXTRACCIÓN DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS MEDIANTE DISOLVENTES QUÍMICOS
1. INTRODUCCIÓN
En las plantas superiores, la fotosíntesis es posible debido a la presencia en el cloroplasto,
concretamente en las membranas tilacoidales, de una serie de pigmentos que tienen capacidad para captar
la luz. Existen dos tipos básicos de pigmentos fotosintéticos:
Clorofilas.Compuestas por una
porfirina que lleva incorporado un átomo de
magnesio en el centro del núcleo tetrapirrólico
. El ión Mg2* está coordinado con los cuatro
átomos de nitrógeno centrales, lo que hace de
la clorofila un complejo extraordinariamente
estable. La "cabeza" que acabamos de
describir, está unida a una "cola", el fitol, que
es un alcohol de 20 átomos de carbono.
Cabeza y cola seunen a través de un enlace
éster en el que intervienen el grupo alcohólico
del fitol y el grupo carboxilo de un ácido
propiónico que está unido al anillo IV del
núcleo tetrapirrólico. Existen varios tipos de
clorofilas, las más importantes de las cuales
son la "a", y la "b". La clorofila a tiene un
grupo -CH3 en el anillo II mientras que la
clorofila b tiene un grupo -CHO en esa mismaposición.
Carotenoides. Actúan como pigmentos
accesorios en el proceso de la fotosíntesis.
Existen dos tipos de pigmentos carotenoides:
carotenos y xantofilas.
Los carotenos son hidrocarburos
isoprenoides que no contienen oxígeno y están
formados por largas moléculas con un sistema
de enlaces conjugados alternantes, dobles y
sencillos, rematados en cada extremo por un
anillo de ciclohexanoinsaturado- tienen color
amarillo-anaranjado.
Las xantofilas tienen una estructura
muy similar a la de los carotenos y su
diferencia estriba en la incorporación de
oxígeno en los extremos de la molécula. Según
el grupo que se incorpore existen variedades
dentro de las xantofilas. Son de color amarillo.

Imágenes tomadas de Buchanan, Gruissen & Jones. Biochemistry
& Molecular Biology ofPlants. American Society of Plant
Biologists. Rockville, Maryland. USA. 2000

2. OBJETIVO
Separar clorofilas a y b, carotenos y xantofilas basándose en sus diferencias de solubilidad, que a
su vez, son una consecuencia de sus diferencias estructurales.
3.MATERIAL
Hojas frescas o secas de espinaca o de acelga
2 pipetas de 20 y 5 ml
Embudo, papel de filtro y centrífuga

1

GranatarioMortero y mano
Probeta graduado de 100 ml
Ampolla de decantación de 250 ml
2 Erlenmeyer de 125 ml
Gradilla y dos tubos de ensayo gruesos
Acetona
Éter de petróleo de entre 60 y 80 º
Metanol acuoso del 92% v/v (atención es tóxico por inhalación y en contacto con la piel)
Éter etílico
Solución de KOH al 30% p/v en metanol
Carbonato cálcico

4. METODOLOGÍA
A 5 g de hojas frescas1 desnerviadasy troceadas, se les añaden 25 ml de acetona al 100%
(preferiblemente con una pizca de carbonato cálcico para neutralizar los tejidos ácidos y prevenir una
pérdida parcial de magnesio de las clorofilas) y se machaca la mezcla en el mortero.
Una vez obtenido el extracto, se filtra a través de papel o bien se centrifuga durante 3 minutos a
7000 rpm con objeto de eliminar los restos celulares. Lasolución resultante contiene clorofilas a y b,
carotenoides y moléculas incoloras solubles en acetona.
El siguiente paso consiste en cambiar el disolvente, la acetona, por éter de petróleo. Para ello, se
toman 30 ml de éter de petróleo y se llevan a una ampolla de decantación ¡asegúrate de que está
cerrada la salida!. Se añaden 20 ml del extracto. A continuación, y con objeto de eliminar laacetona, se
añaden 35 ml de agua destilada a la mezcla, lentamente y dejándola resbalar por las paredes. Se agita
suavemente y se espera hasta que se separen dos capas, en la superior estarán los pigmentos que se
pretenden separan y en la inferior la mezcla de acetona y agua. Se abre la llave de la ampolla, se recoge
esta última capa y se tira. Se repite el lavado con agua dos veces más, y en...