Extracción DNA

Obtención del DNA a partir de sangre periférica

Se obtuvieron 10mL de sangre periférica por venopunción. Las células nucleadas de la sangre se aislaron mediante centrifugación repetida y lisiseritrocitaria con solución hipotónica (centrifugación de la sangre total en 50mL de ddH2O durante 30 minutos, 1500 rpm, a 4ºC). Tras la recuperación de la interfase y lisis de los glóbulos rojos conagua destilada, se lavaron las células mononucleadas en tampón Fornace (0.25M Sacarosa; 50mM Tris-HCl pH: 7.5; 25mM KCl; 5mM MgCl2) y se precipitaron mediante centrifugación a 580 g durante 20 minutos.El botón de células nucleadas de la sangre se resuspendió en tampón Fornace a una concentración estimada de 5x106 células/mL, tras lo cuál se añadió EDTA (ácido etilendiamino-tetraacético,concentración final 10 mM), SDS (Dodecil sulfato sódico, concentración final 1%) y Proteinasa K (Boehringer Mannheim, concentración final 50 μg/mL). La mezcla se incubó a 55 ºC durante 8-16 horas55. Tras laincubación, se procedió a purificar el ADN con fenol y cloroformo.
La concentración y el grado de contaminación proteica del ADN así obtenido, se calculó tras medir su absorbancia a 260 y 280 nm,respectivamente, en un espectrofotómetro (GeneQuant, Pharmacia) por medio de la siguiente fórmula:
μg de DNA/mL = (D.O.260) x (factor de dilución) x (50)
Nota: 50 es un factor de corrección introducido yaque una unidad de densidad óptica con una luz incidente de 260 nm es el valor de absorbancia que tienen 50 μg de ADN/mL.
El cociente D.O.260/D.O.280 se utiliza para determinar el grado decontaminación proteica, considerando como valores adecuados un cociente entre 1.65 y 2.0. Valores inferiores a los señalados indican contaminación por proteínas o por solventes orgánicos, realizándose en estoscasos una nueva purificación del ADN. Valores superiores parecen indicar un exceso de ARN, el cuál se eliminó tratando la solución de ADN con RNAsa y purificando nuevamente según el método antes...