Extracción

EXTRACCIÓN, REPLICACIÓN, CONFIRMACIÓN E INSERCÍON DEL GEN GST EN UN PLÁSMIDO VECTOR pBSK, EXTRAIDOS DE DOS CEPAS DE Escherichia coli.
Capellán, Radhames & Alain Prepo
{radhamesc@gmail.com alainsp23@gmail.com}
Universidad de Carabobo, Facultad Experimental de Ciencias y Tecnología, Departamento de Biología, Laboratorio de Biotecnología, Naguanagua Edo. Carabobo.

Resumen
En los últimosaños, se han desarrollado nuevas técnicas moleculares de tipificación basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que han supuesto un importante avance en el estudio de los ácidos nucleídos; además, el empleo de enzimas de restricción, ligasas y la utilización de plásmidos como vectores de genes específicos, son elementos que de cierta forma facilitan el estudio que engloban dichasmoléculas. Los procedimientos en laboratorio para usar un plásmido como vector requiere una series de procesos que van desde la extracción, amplificacion con PCR y corte del ADN de interés para su posterior ligando al plásmido a usar como vector y con esto poder realizar transformación de células competentes. En la extracción de plásmidos pBSK y pBBM11, al caracterizar mediante geles de agarosa en lacorrida se observaron dos bandas difusas en el carril 1 y 5, que evidenciaron la presencia de ADN solo del plásmido pBSK. El gen GST luego de su amplificación se encontró en secciones de gel de agarosa con tamaños entre 600pb y 750pb. Durante el corte los carriles con el plásmido pBSK presentaron un peso de aproximadamente 3000 pb (plásmido lineal). En el carril 5 se observo una bandacorrespondiente a los 2914 pb que es el pBSK abierto, una segunda banda mayor a 4000 pb que debe presentar una conformación de circular relajado y la banda de entre 44 y 45 pb, esto debido a la acción de las enzimas de restricción, las cuales, cortaron el fragmento del sitio de clonación múltiple (MCS). Los carriles con el gen GST (de 699 pb) presentaron bandas entre 500 y 750 pb.
IntroducciónActualmente la ingeniería genética se encuentra en constante avance, debido a que cada día existen más técnicas para el tratamiento del DNA. En los últimos años, se han desarrollado nuevas técnicas moleculares de tipificación basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que han supuesto un importante avance en el estudio de los ácidos nucleicos; además, el empleo de enzimas de restricción,ligasas y la utilización de plásmidos como vectores de genes específicos, son elementos que de cierta forma facilitan el estudio que engloban dichas moléculas (Fernández, 2005). El procedimiento básico de la PCR, involucra la construcción de primers de oligonucleótidos que son complementarios a las secuencias de cadenas opuestas del gen que se quiere clonar uniéndose un par de bases separado del gen.La muestra de ADN a clonar es desnaturalizada por calor a sus respectivas cadenas, dando espacio a que los primers a que se alineen con sus secuencias complementarias respectivas, ya unido el cebador y con suficiente dexosinucleotidos (Lodish et al., 2006)(Hillis & Moritz 1990).Actualmente la enzima más universalmente empleada es la Taq polimerasa extraída del microorganismo Thermus aquaticus,además de estar formada por una secuencia corta de seis nucleótidos, permite la síntesis de ADN a temperaturas por encima de los 70ºC y resiste perfectamente entre 94- 95ºC necesarios para separar las dos hebras de ADN (López et al., 1999).En el caso particular de la utilización de plásmidos como vectores, es una idea llamativa en la ingeniería genética; ya que estas moléculas constan de pequeñossegmentos de ADN extracromosómicos, mayormente circulares, cerrados covalentemente y superenrrollados, que se originan en la mayoría de las cepas bacterianas y en algunos eucarióticos; de modo que se pueden conseguir fácilmente. Su tamaño es variable (1,5 kb-300 kb); y con frecuencia, portan genes resistentes a antibióticos o metales pesados, genes para la metabolización de sustratos atípicos...