Extracci n de ADN de hongos 222
Páginas: 12 (2768 palabras)
Publicado: 13 de septiembre de 2015
Extracción de ADN a partir de hongos
Doc. María jose
Integrantes: Jorge Andrés Álvarez rodríguez
Luis ángel guzmán
Universidad de sucre
Facultad de educación y ciencias
Programa de biología
Sincelejo-sucre
2015
INTRODUCCIÓN
La mayoría de las técnicas de biología molecular que se aplican en hongos, involucran como pasos esenciales la extracción, purificación y análisis de ADN,en esta experiencia se logró el aislamiento y la extracción de ácidos nucleicos a partir de hongos lo cual implica una serie de etapas realizadas esenciales para la obtención eficaz de DNA. Inicialmente se da la ruptura mecánica de las células y suspensión de los núcleos en un buffer estabilizante. Es una etapa crítica, porque el rendimiento final puede verse reducido si no se rompen bien lascélulas, o si no se protege el ADN durante el proceso. Para romper el tejido y suspender los núcleos en la solución se utilizan métodos mecánicos. Generalmente se efectúa una homogenización (con mortero, vórtex, en este caso se usó un pistilo) que tiene por objeto romper el tejido y molerlo a un grado muy fino. Posteriormente la acción de agentes que producen la lisis de membranas, separan el ADNde los otros componentes celulares (proteínas, carbohidratos, membranas y paredes celulares), y lo liberan en la solución. En esta etapa debe lograrse que el ADN se disocie completamente de las proteínas y otros contaminantes que pueden coextraerse y por lo tanto interferir con los análisis subsiguientes. También debe evitarse perder una cantidad significativa de ADN junto con los restoscelulares. En general se usan soluciones buffers de extracción que contienen diversos agentes químicos: detergentes fuertes, que disocian las proteínas del ADN y actúan simultáneamente como inhibidores de las nucleasas endógenas que podrían degradarlo. Finalmente la purificación del ADN mediante precipitaciones y resuspensiones sucesivas y concentración. Para separar el ADN de impurezas y de las solucionesde extracción, se utilizan uno o más ciclos de precipitación-resuspensión. En líneas generales, la precipitación se produce cuando se trata la solución de ADN con una sal en presencia de un alcohol, trabajando a bajas temperaturas (-20 °C o menor). En estas condiciones se forma un precipitado, que son las sales de los ácidos nucleicos. Este precipitado (que se visualiza como un flóculo o "nube"que flota en la suspensión) se sedimenta mediante centrifugación. Luego se elimina el sobrenadante, y el pellet de ADN se resuspende en agua o en un buffer apropiado. Por lo tanto existen una gran cantidad de métodos para extraer y purificar ADN vegetal, y la elección de uno en particular dependerá del tejido y del objetivo del ensayo. En esta experiencia se tiene como enfoque principal laextracción de ácidos nucleicos a partir de hongos. Por tal razón el método utilizado proporciona cantidades relativamente puras de DNA genómico, que puede usarse como molde en diversas técnicas del campo de biología molecular.
Objetivos
Desarrollar habilidades y destrezas en la extracción de ADN
Extraer ADN de hongos (fusarium spp, colletotrichum ssp.) por un método sencillo y efectivo
Metodología
Sepreparó 50 mg de dos tipos de hongos
Se maceraron las muestras
Se agregó 25µl de proteinasa k al buffer
Se les agrego 600µl a las dos muestras
Se llevó al baño de maría durante una hora en donde se sacaron las muestras cada 15 min para hacer inmersión durante 5min
Se agredo 150µl de acetato de amonio a las muestras
Se agitaron las muestras 15 minutos
Se centrifugaron estas a 12.000rpm durante 15 min
Se pasó el sobrenadante a otros tubos
Se les agrego a las muestras cloroformo y se agito por diez minutos
Se centrifugo a 12.000 rpm durante 15 min
Se volvió a sacar el sobrenadante y se le hecho a el hongo f(300) 150µl de isopropanol y al hongo C(200) 100 µl
Se dejaron las muestras en frio durante 24 aprox.
Se centrifugo de nuevo las muestras durante 15 min
De...
Doc. María jose
Integrantes: Jorge Andrés Álvarez rodríguez
Luis ángel guzmán
Universidad de sucre
Facultad de educación y ciencias
Programa de biología
Sincelejo-sucre
2015
INTRODUCCIÓN
La mayoría de las técnicas de biología molecular que se aplican en hongos, involucran como pasos esenciales la extracción, purificación y análisis de ADN,en esta experiencia se logró el aislamiento y la extracción de ácidos nucleicos a partir de hongos lo cual implica una serie de etapas realizadas esenciales para la obtención eficaz de DNA. Inicialmente se da la ruptura mecánica de las células y suspensión de los núcleos en un buffer estabilizante. Es una etapa crítica, porque el rendimiento final puede verse reducido si no se rompen bien lascélulas, o si no se protege el ADN durante el proceso. Para romper el tejido y suspender los núcleos en la solución se utilizan métodos mecánicos. Generalmente se efectúa una homogenización (con mortero, vórtex, en este caso se usó un pistilo) que tiene por objeto romper el tejido y molerlo a un grado muy fino. Posteriormente la acción de agentes que producen la lisis de membranas, separan el ADNde los otros componentes celulares (proteínas, carbohidratos, membranas y paredes celulares), y lo liberan en la solución. En esta etapa debe lograrse que el ADN se disocie completamente de las proteínas y otros contaminantes que pueden coextraerse y por lo tanto interferir con los análisis subsiguientes. También debe evitarse perder una cantidad significativa de ADN junto con los restoscelulares. En general se usan soluciones buffers de extracción que contienen diversos agentes químicos: detergentes fuertes, que disocian las proteínas del ADN y actúan simultáneamente como inhibidores de las nucleasas endógenas que podrían degradarlo. Finalmente la purificación del ADN mediante precipitaciones y resuspensiones sucesivas y concentración. Para separar el ADN de impurezas y de las solucionesde extracción, se utilizan uno o más ciclos de precipitación-resuspensión. En líneas generales, la precipitación se produce cuando se trata la solución de ADN con una sal en presencia de un alcohol, trabajando a bajas temperaturas (-20 °C o menor). En estas condiciones se forma un precipitado, que son las sales de los ácidos nucleicos. Este precipitado (que se visualiza como un flóculo o "nube"que flota en la suspensión) se sedimenta mediante centrifugación. Luego se elimina el sobrenadante, y el pellet de ADN se resuspende en agua o en un buffer apropiado. Por lo tanto existen una gran cantidad de métodos para extraer y purificar ADN vegetal, y la elección de uno en particular dependerá del tejido y del objetivo del ensayo. En esta experiencia se tiene como enfoque principal laextracción de ácidos nucleicos a partir de hongos. Por tal razón el método utilizado proporciona cantidades relativamente puras de DNA genómico, que puede usarse como molde en diversas técnicas del campo de biología molecular.
Objetivos
Desarrollar habilidades y destrezas en la extracción de ADN
Extraer ADN de hongos (fusarium spp, colletotrichum ssp.) por un método sencillo y efectivo
Metodología
Sepreparó 50 mg de dos tipos de hongos
Se maceraron las muestras
Se agregó 25µl de proteinasa k al buffer
Se les agrego 600µl a las dos muestras
Se llevó al baño de maría durante una hora en donde se sacaron las muestras cada 15 min para hacer inmersión durante 5min
Se agredo 150µl de acetato de amonio a las muestras
Se agitaron las muestras 15 minutos
Se centrifugaron estas a 12.000rpm durante 15 min
Se pasó el sobrenadante a otros tubos
Se les agrego a las muestras cloroformo y se agito por diez minutos
Se centrifugo a 12.000 rpm durante 15 min
Se volvió a sacar el sobrenadante y se le hecho a el hongo f(300) 150µl de isopropanol y al hongo C(200) 100 µl
Se dejaron las muestras en frio durante 24 aprox.
Se centrifugo de nuevo las muestras durante 15 min
De...
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