Extracci N De Cidos Nucleicos

Extracción de ácidos nucleicos
Diego Fernando Uribe
Profesor Ing. Biomédica
Facultad de Ciencias Exactas Aplicadas
2015-1

Importancia del estudio de los ácidos
nucleicos
• Diversas aplicaciones
biomedicina:

en

investigación

y

en

• Aplicaciones en ciencia: Ingeniería de tejidos, clonación, ADN
recombinante, entre otros.
• Aplicaciones en medicina: estudios de la herencia de la
enfermedad enlas familias, diagnóstico y tratamiento
enfermedades
• Aplicaciones en ciencias forenses: identificación de
individuos (violadores, asesinos, ladrones, victimas de guerra,
etc) y pruebas de paternidad.

Objetivo
• Para liberar los ácidos nucleicos de las células
para su uso en otros procedimientos
• Debe estar libre de contaminación con
proteínas, carbohidratos, lípidos u otros
ácidos nucleicos• Ácidos nucleicos puros son aptos para ser
utilizados en las diferentes pruebas

Extracción de ácidos nucleicos
• Existen muchos métodos y tecnologías diferentes están
para el aislamiento de ácidos nucleicos
• Todos los métodos implican:
A. Disrupción y lisis del material de partida seguido de
B. La eliminación de proteínas y otros contaminantes y,
finalmente,
C. Recuperación de los ácidosnucleicos

Extracción de ácidos nucleicos
• Rutinariamente aislado a partir de diferentes fuentes:
células humanas
hongos
bacterias
virus
parásitos
plantas
cultivos celulares

• Deben realizarse algunos procedimientos previos para que las células
estén disponibles para la extracción:
sangre total , muestras de tejidos, microorganismos
• Necesidad de muestra suficiente para el rendimiento adecuadoObtención de muestras
“Edad” de la muestra:
• Puede ser nuevo o puede haber sido almacenada.
Muestra almacenada puede provenir de:
• Muestras de tejido archivadas

• Sangre congelada o tejido (material de biopsia)
• Huesos o tejidos exhumados

• Muestra humana antigua
• Manchas de sangre seca

Parámetros importantes!
• La separación de ADN y ARN de otros componentes celulares
tales como proteínas,lípidos, ARN o ADN, según el caso
• Evitar la fragmentación de las moléculas de ácidos nucleicos
por disrupción mecánica o la acción de las nucleasas
endógenas (DNasas y RNasas)
Estas enzimas generalmente pueden inactivarse mediante el uso de
calor o de agentes quelantes.

Extracción de ácidos nucleicos
Pasos clave
• La lisis de las células
• La eliminación de
contaminantes incluye
proteínas y otrasmacromoléculas

• Determinar la concentración
de los ácidos nucleicos
purificados

Lisis de las células
• Los detergentes son una clase de moléculas cuyas propiedades únicas
permiten la manipulación (interrupción o formación) de interacciones entre
moléculas hidrofóbicas-hidrofílicas en muestras biológicas. Al igual que los
componentes de las membranas biológicas, los detergentes tienenpropiedades hidrófobas, sin embargo, son en sí mismos solubles en agua.
En consecuencia, las moléculas de detergentes permiten la dispersión
(miscibilidad) de los compuestos hidrófobos, insolubles en agua en medios
acuosos, incluyendo la extracción y solubilización de proteínas de
membrana.

Métodos de extracción
• “Caseros” o comerciales
• Dentro de los “caseros”, hay métodos orgánicos e
inorgánicosOrgánicos: se llevan a cabo mediante la combinación de
alto contenido de sal, pH bajo y una mezcla de
compuestos orgánicos (fenol-cloroformo)
Inorgánicos: utiliza un pH bajo y alta concentración de
sales para precipitar selectivamente las proteínas
(salting-out)

Fenol:Cloroformo
• Fenol: cloroformo se utiliza para extraer ADN

• Cuando el fenol se mezcla con el lisado celular, se forman dos fases.ADN (y ARN) en la fase acuosa (superior) y proteínas
desnaturalizadas en la fase orgánica (inferior)
• Fenol: desnaturaliza las proteínas y las solubiliza
• Se recupera la fase superior y se añade etanol frío para precipitar el
ADN

TRIzol
• TRIzol® se ofrece en varios formatos listos para su
uso. Los productos individuales dentro de la familia
del reactivo TRIzol® están diseñados para...