Extraccion De Acidos Nucleicos

OBJETIVOS
* Describir los diferentes métodos que existen de extracción de ácidos nucleícos.

* Comparar otros métodos de extracción de ácidos nucleícos con el método de Boom, para así poder identificar sus similitudes y sus diferencias.

INTRODUCCION
Hay diferentes técnicas que permiten obtener ácidos nucleicos con alto grado de pureza. Las más utilizadas suelen incluir una etapa deultracentrifugación en gradientes de CsCl o una cromatografía de intercambio iónico. Sin embargo, muchas aplicaciones de laboratorio no necesitan un grado de pureza tal que justifique incluir estas técnicas (laboriosas y/o caras) en los protocolos de purificación.
En el caso particular del ARN, la gran abundancia y robustez de las ribonucleasas (enzimas que degradan específicamente ARN)celulares y de posibles contaminaciones ambientales, hace necesarios métodos y precauciones especiales. Estos incluyen la utilización de agentes fuertemente desnaturalizantes, o inhibidores específicos, que inactiven tales ribonucleasas. Debido a todo esto, en el práctico solo se realizarán purificaciones de ADN.
Las etapas del procedimiento que se utilizará en
• Desintegración del tejido ysolubilización de los componentes celulares
• Precipitación de los ácidos nucleicos y disolución en un buffer adecuado

MARCO TEORICO
PCR en tiempo real
La PCR en Tiempo Real es, básicamente, una PCR convencional en la que los equipos de amplificación (termocicladores) llevan incorporados un sistema de detección de fluorescencia (fluorímetro), basándose la tecnología en la utilización de unasmoléculas específicas denominadas fluoróforos y quenchers. Ambos factores, nos va a permitir monitorizar, en tiempo real, lo que esta ocurriendo dentro de cada tubo en cada ciclo de amplificación y va a sustituir a los pasos de amplificación, electroforesis y análisis de imagen de una PCR tradicional.
Los factores que afectan a la PCR cuantitativa son, entre otros:
* ™optimización delprotocolo de reacción para maximizar su eficiencia. Hay que tener en cuenta que una pequeña diferencia en la eficiencia de reacción por ciclo, puede originar una substancial diferencia en la cantidad final de producto; por ejemplo, si una reacción es tan solo un 90% tan eficiente como otra, la relación de producto final entre ambas reacciones después de 40 ciclos será alrededor de 65 a 1
*Evitar un número excesivo de ciclos de amplificación
* Un adecuado procesamiento de las muestras que asegure la eliminación de los inhibidores que pueden disminuir la eficiencia de amplificación
El parámetro fundamental en una PCR en Tiempo Real y en función del cual se van a realizar todos los cálculos analíticos y obtención de resultados, es el denominado Ciclo Umbral (Threshold Cycle oCt), que se define como el ciclo a partir del cual la fluorescencia es estadísticamente significativa por encima del ruido de fondo (background).
Las principales propiedades de este parámetro Ct son:
* Separa los datos del ruido de fondo
* Determina el ciclo inicial de amplificación
* Es inversamente proporcional al número de copias inicial del templaste.
* se suele establecercomo 10 veces el ruido de fondo, aunque se puede modificar manualmente.
Una de las principales ventajas de la PCR en Tiempo Real frente a la PCR convencional (aparate de su mayor sensibilidad) es que a la hora de cuantificar, en la PCR convencional se hace en función del producto final y debido a que la propia PCR es una reacción enzimática, las variaciones que se pueden observar son muysignificativas; sin embargo, en la PCR en Tiempo Real, dicha cuantificación se realiza en función del valor de Ct, que al ser al principio de la amplificación, no se ve afectado por todas esas variaciones, con lo que los resultados son completamente reproducibles y mucho más precisos. En la siguiente figura se muestran los resultados de 96 replicados de una muestra puestos en una misma placa de PCR...