Extraccion De Adn En Tejidos Embebidos En Parafina

EXTRACCIÓN DE ADN EN TEJIDOS EMBEBIDOS EN PARAFINA POSITIVOS Mycobacterium avium subp. Paratuberculosis UTILIZANDO LA RESINA QUELANTE CHELEX- 100 AL 5%.
Pérez Mendoza José Luis
Universidad Autónoma de Sinaloa
Jose_luis_emvz22@hotmail.com

Asesor MC. Martin López Valenzuela, Lab. Patología FMVZ-UAS.
martin@uas.uasnet.mx

INTRODUCCIÓN
La paratuberculosis (PTB) o enfermedad de Johne esuna patología que afecta a los rumiantes domésticos y silvestres, ocasionada por Mycobacterium avium, subsp. Paratuberculosis (MAP) (Wynne et al., 2011; Jaimes et al., 2008; Restrepo et al., 2008; Favila et al., 2007; Kruze et al., 2007; Cirone et al., 2006); es un bacilo Gram positivo ácido-alcohol resistente, intracelular facultativo (Ramírez et al., 2011; Castellanos, 2010); que infecta a losmacrófagos de la lámina propia del intestino en las placas de Peyer del íleon y yeyuno (Alfaro et al., 2006; Chávez-Gris, 2006). La vía de infección es fecal-oral, a través de la ingestión de agua, leche y alimentos contaminados con materia fecal que contiene a MAP (Restrepo et al., 2008); ocasionando una enteropatía granulomatosa, que se caracteriza por pérdida progresiva de la condicióncorporal y diarrea crónica o intermitente (Ramírez et al., 2011; Jaimes et al., 2008; Alfaro et al., 2006). El tejido embebido en parafina (TEP) es una fuente invaluable para los estudios moleculares retrospectivos en la patología; el método Chelex-100 ha sido empleado para la extracción de ADN en TEP para utilizarse posteriormente en la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). ElChelex-100 es una resina que captura iones metálicos polivalentes en soluciones y su efecto es prevenir a través de su acción quelante la ruptura del ADN a altas temperaturas catalizada por los iones involucrados en las muestras de trabajo. (De Armas et al., 2006).

OBJETIVO
Probar la efectividad de la resina quelante chelex-100 al 5%, para extracción de "ADN" a partir de TEP de muestraspositivas a MAP.
METODOLOGÍA
El siguiente trabajo se realizó en el laboratorio de patología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Sinaloa FMVZ- UAS, ubicado sobre el Boulevard Ángeles s/n en el fraccionamiento San Benito, con las siguientes coordenadas geográficas: Altitud 24°46´16.95” y Longitud 107°21´17.74” en el municipio de Culiacán, Sinaloa, México(INEGI, 2010).
Para llevar acabo la extracción de ADN, se procedió a realizar cortes histológicos de 14 µm en un micrótomo LeicaMR en 10 muestras de tejido intestinal embebido en parafina de animales positivos a bacilos acido alcohol resistentes mediante tinción Zihel Neelsen, los cuales fueron colocados en microtubos eppendorf de 1.5 ml.
El procedimiento de extracción de ADN de loscortes histológicos en bloques de parafina fue llevado a cabo utilizando 300 µl de una solución de Chelex-100 (Sigma- Aldrich, USA) al 5% la cual se preparó en un volumen total de 20 ml por 1g de reactivo con agua inyectable estéril (De Armas et al., 2006)posteriormente se calentó a 100°C por 30 minutos y se centrifugó a 13.000 rpm durante 10 min transfiriendo el sobrenadante a un microtubo de0,5 ml estéril, cuidadosamente sin tocar la pastilla, para después conservar el ADN a -20°C, para su posterior uso en la visualización de los resultados.
Se preparó el gel de agarosa al 1.5% en solución TAE 1X. La agarosa se depositó en un matraz Erlenmeyer limpio y seco de 250 ml, agregando 150 ml de TAE 1X. Se calentó por 1:30 minutos en un horno microondas y se agitó agregándole 15 µl deGelRedMR a razón de 5 µl por cada 50 ml de agarosa preparada. Se colocó el gel dentro de una cámara de electroforesis, previamente preparada con sus peinillas y se dejó enfriar por 40 minutos.
De las muestras en las que se realizó la extracción con el Chelex-100 al 5%, se procedió a someterlas a electroforesis en dos geles de agarosa al 1.5% cargando con una micropipeta en cada uno de los...