EXTRACCION DE ADN EXPO
Páginas: 2 (376 palabras)
Publicado: 11 de julio de 2015
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/extraccion.pdf
http://www.microbial-systems.com/web/docs/Newsletter_Microbial_03.pdf
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/530/cap16.pdfColecta de la muestra
Foliolos jóvenes y sanos de la hoja.
Homogeneización del tejido
El tejido foliar fue pulverizado con ayuda de nitrógeno líquido
En un tubo Epependorff de 1,5 mL se tomó unacantidad aproximada de 500 mg de tejido molido.
Lisis celular
Luego se agregaron 1,2 mL de solución de extracción caliente (Tris HCl 100 mM, EDTA 50 mM, NaCl 500 mM, β-mercaptoetanol 10 mM y PVP1% [p/v]
Posteriormente se agregaron 85 μL de SDS (dodesilsulfato de sodio) al 20%.
Degradación de la fracción proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adición de una proteasa.
Los tubos seincubaron en baño maría a 65°C durante 30 min y luego se agregaron 390 μL de acetato de potasio 5 M.
La mezcla se centrífugó a 12.500 xg durante 15 min
Purificación. Consta de 3 fases:Precipitación del ADN
El sobrenadante se transfirió a un tubo, al cual se adicionó 1 mL de isopropanol Frío.
La mezcla se incubó a –20° C durante toda la noche.
Después se centrifugó a 25.000 xg durante 30 miny se desechó el líquido teniendo cuidado de no perturbar el botón de ADN.
Lavado pellet ADN
El botón de ADN, se lavó con 2 mL de etanol al 70% para luego centrifugarlo a 25.000 xg durante 3 min.Recuperación:
Se dejó secar el botón a temperatura ambiente y se le adicionaron 350 μL de solución TE-ARNasa (10 mM de Tris HCl a pH 8,0; 1 mM de EDTA a pH 8,0;
5 mg· mL-1 de ARNasa)
Se incubó a37° C durante 15 min. El ADN obtenido se almacenó a 4° C para su posterior utilización.
Cuantificación
Para la cuantificación del ADN se utilizó un método comparativo teniendo como patrón dereferencia un ADN genómico de tomate de concentración conocida.
Se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 0,7 % (p/v) en donde se colocó el ADN de tomate a diferentes concentraciones,
El cual se...
http://www.microbial-systems.com/web/docs/Newsletter_Microbial_03.pdf
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/530/cap16.pdfColecta de la muestra
Foliolos jóvenes y sanos de la hoja.
Homogeneización del tejido
El tejido foliar fue pulverizado con ayuda de nitrógeno líquido
En un tubo Epependorff de 1,5 mL se tomó unacantidad aproximada de 500 mg de tejido molido.
Lisis celular
Luego se agregaron 1,2 mL de solución de extracción caliente (Tris HCl 100 mM, EDTA 50 mM, NaCl 500 mM, β-mercaptoetanol 10 mM y PVP1% [p/v]
Posteriormente se agregaron 85 μL de SDS (dodesilsulfato de sodio) al 20%.
Degradación de la fracción proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adición de una proteasa.
Los tubos seincubaron en baño maría a 65°C durante 30 min y luego se agregaron 390 μL de acetato de potasio 5 M.
La mezcla se centrífugó a 12.500 xg durante 15 min
Purificación. Consta de 3 fases:Precipitación del ADN
El sobrenadante se transfirió a un tubo, al cual se adicionó 1 mL de isopropanol Frío.
La mezcla se incubó a –20° C durante toda la noche.
Después se centrifugó a 25.000 xg durante 30 miny se desechó el líquido teniendo cuidado de no perturbar el botón de ADN.
Lavado pellet ADN
El botón de ADN, se lavó con 2 mL de etanol al 70% para luego centrifugarlo a 25.000 xg durante 3 min.Recuperación:
Se dejó secar el botón a temperatura ambiente y se le adicionaron 350 μL de solución TE-ARNasa (10 mM de Tris HCl a pH 8,0; 1 mM de EDTA a pH 8,0;
5 mg· mL-1 de ARNasa)
Se incubó a37° C durante 15 min. El ADN obtenido se almacenó a 4° C para su posterior utilización.
Cuantificación
Para la cuantificación del ADN se utilizó un método comparativo teniendo como patrón dereferencia un ADN genómico de tomate de concentración conocida.
Se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 0,7 % (p/v) en donde se colocó el ADN de tomate a diferentes concentraciones,
El cual se...
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