Extraccion de adn total
Páginas: 2 (268 palabras)
Publicado: 1 de julio de 2014
Extracción de DNA total de E. Coli.
La metodología siguiente es una de las primeras que se usó para la extracción de DNA genómico.
Para extraer DNA total esconveniente partir de un cultivo fresco y saturado.
Debido a su gran tamaño (4.7 x 10 6 pb), y a su extrema fragilidad su extracción debe realizarse con sumocuidado. No se debe usar el vortex en ningún paso después de que la lisis celular tuvo lugar. En cambio debe mezclarse por inversión del tubo eppendorff.
Este métodoconsta de tres etapas principales: un crecimiento celular, un paso de lisis que se efectua con lisozima y Tritón, y un último paso de precipitación alcohólica.
Por lagran cantidad de DNA que se logra precipitar es posible verlo como una gran fibra que se puede extraer físicamente enrollándola en un tip de micropipeta o en unavarilla de vidrio.
a) Crecer un cultivo de 5 ml overnight 37°C.
b) Peletear en eppendorff de 1.5 ml tres veces, 1 min. a 14000 rpm.
c) Resuspender en 200 ulde TE
d) Centrifugar 1min a 14000 rpm
e) Descartar el sobrenadante
f) Resuspender en 200 ul de buffer TE (5X ) a 4°C + 20 % de sacarosa .
g) Agregar lisozimasólida ( punta de espátula). Incubar a 37 °C 15 min.
h) Agregar 0.05 ml EDTA (0.5 M, pH 8.5).
i) Añadir 0.4 ml de Triton 10%. Mezclar por inversion.
j) Agregar 0.8vol de isopropanol
k) Incubar a –20°C 10 min.
l) Tomar un tips y enrollar en el mismo el ovillo de DNA observable.
m) Pasar a otro eppendorf y dejar secar .
n)Redisolver el precipitado en 200 ul de H20
Referencias
1)Molecular cloning. Vol 1. Maniatis
2)Experiments in Molecular Biology. Cap 1 Robert J. Slater
La metodología siguiente es una de las primeras que se usó para la extracción de DNA genómico.
Para extraer DNA total esconveniente partir de un cultivo fresco y saturado.
Debido a su gran tamaño (4.7 x 10 6 pb), y a su extrema fragilidad su extracción debe realizarse con sumocuidado. No se debe usar el vortex en ningún paso después de que la lisis celular tuvo lugar. En cambio debe mezclarse por inversión del tubo eppendorff.
Este métodoconsta de tres etapas principales: un crecimiento celular, un paso de lisis que se efectua con lisozima y Tritón, y un último paso de precipitación alcohólica.
Por lagran cantidad de DNA que se logra precipitar es posible verlo como una gran fibra que se puede extraer físicamente enrollándola en un tip de micropipeta o en unavarilla de vidrio.
a) Crecer un cultivo de 5 ml overnight 37°C.
b) Peletear en eppendorff de 1.5 ml tres veces, 1 min. a 14000 rpm.
c) Resuspender en 200 ulde TE
d) Centrifugar 1min a 14000 rpm
e) Descartar el sobrenadante
f) Resuspender en 200 ul de buffer TE (5X ) a 4°C + 20 % de sacarosa .
g) Agregar lisozimasólida ( punta de espátula). Incubar a 37 °C 15 min.
h) Agregar 0.05 ml EDTA (0.5 M, pH 8.5).
i) Añadir 0.4 ml de Triton 10%. Mezclar por inversion.
j) Agregar 0.8vol de isopropanol
k) Incubar a –20°C 10 min.
l) Tomar un tips y enrollar en el mismo el ovillo de DNA observable.
m) Pasar a otro eppendorf y dejar secar .
n)Redisolver el precipitado en 200 ul de H20
Referencias
1)Molecular cloning. Vol 1. Maniatis
2)Experiments in Molecular Biology. Cap 1 Robert J. Slater
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