Extraccion De Adn Vegetal Articulo Cientifico
Páginas: 5 (1064 palabras)
Publicado: 17 de febrero de 2013
EXTRACCIÓN DE ADN VEGETAL Y SU VISUALIZACIÓN MEDIANTE ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
Samayoa Zepeda Cindy Massielle
Universidad de El Salvador, Facultad Multidisciplinaria de Occidente, Departamento de Biología.
Introducción
El ADN es un polímero de doble cadena, constituido por cuatro desoxinucleotidos (adenina, guanina, timina y citosina) ligados por uniones fosfodiester en ordenespecifico, a menudo con un mensaje codificado.
La extracción de ADN tiene como objetivo principal obtener la mayor cantidad posible del ADN de alto peso molecular, libre de proteínas, carbohidratos y otros inhibidores de enzimas.
Diferentes métodos de extracción han sido descritos para el aislamiento de ácidos nucleicos, aquí se trabajara específicamente con la extracción de ADN vegetal porel método CTAB (Doyle y Doyle, 1987, modificado por Harris, 1996) y se visualizara mediante electroforesis en gel de agarosa.
La electroforesis en gel es una técnica sencilla empleada de forma rutinaria en laboratorio para separar moléculas biológicas especialmente ADN, ARN y proteínas.
En plantas, la pared celular es la primera barrera para la extracción, es necesario degradarla empleandométodos físicos o químicos. Los métodos físicos son los más empleados, especialmente la congelación y la maceración. Una vez se ha destruido la membrana celular debe emplearse detergentes y soluciones de alta (o baja) fuerza iónica para permitir que el ADN se libere en el buffer.
Algunos tejidos pueden poseer altas concentraciones de polisacáridos, para separarlos de los ácidos nucleicos se puedeemplear mayor cantidad de buffer de extracción o sustancias como CTAB (cetil trimetil amonio) que colabora en la precipitación del ADN.
Objetivos
* Extraer ADN a partir de hojas utilizando el Buffer CTAB mini preparaciones.
* Describir la función de cada uno de los reactivos utilizados para la extracción de ADN de plantas.
* Utilizar adecuadamente los reactivos y el equiponecesario para la extracción de ADN vegetal.
* Aprender la técnica de electroforesis en gel de agarosa y su funcionamiento.
* Visualizar la presencia de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa.
Procedimientos
Método CTAB- mini preparaciones para extraer ADN
Se lavaron hojas jóvenes de eucalipto con abundante agua, luego se secaron con papel toalla, se seleccionaron los mejoresespecímenes y posteriormente se colocaron en un mortero previamente congelado, agregando nitrógeno líquido, macerando fuertemente hasta obtener un polvillo. Con ayuda de una cuchara se traslado el polvo al tubo clínico; adicionándole 1 µl de buffer de CTAB, y se paso a macerar con una microespátula, haciendo fuerza contra las paredes del tubo, se tapo y agito con el vortex.
Hasta uniformizar lasolución, dejándolo en baño de maría a 65 °C por 10 minutos, se dejo enfriar durante 5 minutos y se adiciono solución 24:1 de cloroformo-isoamyl alcohol haciéndolo llegar a 5 ml y se mezclo con el vortex.
Se micro centrífugo por un periodo de 10 minutos. Cuidadosamente se transfirió el sobrenadante a un tubo limpio y se repitió el microcentrifugado por 10 minutos. Posteriormente se transfirió elsobrenadante a un tubo limpio con la ayuda de una micro pipeta de 1 ml, se hizo llegar a los 4 ml del tubo con isopropanol y se mezclo ligeramente para que el ADN precipitara, así poder observar la formación de pequeñas hebras de ADN. Los tubos fueron almacenados en el freezer para su posterior análisis.
Visualización mediante electroforesis en gel de agarosa
Con la solución de agarosa(0.9%), mas el buffer (TBE) ya preparada, la bandeja se coloco en la cámara de electroforesis que contenía buffer TBE.
En papel parafina se colocaron 2 µl de azul de bromofenol, 9 µl de buffer de TE y 9 µl de ADN, posteriormente se coloco cada preparación de la solución que suman 20 µl del ADN coloreado, en los pozos del gel. Por 30 minutos se dejo migrar. Pasado los 30 minutos se saco el gel de...
Samayoa Zepeda Cindy Massielle
Universidad de El Salvador, Facultad Multidisciplinaria de Occidente, Departamento de Biología.
Introducción
El ADN es un polímero de doble cadena, constituido por cuatro desoxinucleotidos (adenina, guanina, timina y citosina) ligados por uniones fosfodiester en ordenespecifico, a menudo con un mensaje codificado.
La extracción de ADN tiene como objetivo principal obtener la mayor cantidad posible del ADN de alto peso molecular, libre de proteínas, carbohidratos y otros inhibidores de enzimas.
Diferentes métodos de extracción han sido descritos para el aislamiento de ácidos nucleicos, aquí se trabajara específicamente con la extracción de ADN vegetal porel método CTAB (Doyle y Doyle, 1987, modificado por Harris, 1996) y se visualizara mediante electroforesis en gel de agarosa.
La electroforesis en gel es una técnica sencilla empleada de forma rutinaria en laboratorio para separar moléculas biológicas especialmente ADN, ARN y proteínas.
En plantas, la pared celular es la primera barrera para la extracción, es necesario degradarla empleandométodos físicos o químicos. Los métodos físicos son los más empleados, especialmente la congelación y la maceración. Una vez se ha destruido la membrana celular debe emplearse detergentes y soluciones de alta (o baja) fuerza iónica para permitir que el ADN se libere en el buffer.
Algunos tejidos pueden poseer altas concentraciones de polisacáridos, para separarlos de los ácidos nucleicos se puedeemplear mayor cantidad de buffer de extracción o sustancias como CTAB (cetil trimetil amonio) que colabora en la precipitación del ADN.
Objetivos
* Extraer ADN a partir de hojas utilizando el Buffer CTAB mini preparaciones.
* Describir la función de cada uno de los reactivos utilizados para la extracción de ADN de plantas.
* Utilizar adecuadamente los reactivos y el equiponecesario para la extracción de ADN vegetal.
* Aprender la técnica de electroforesis en gel de agarosa y su funcionamiento.
* Visualizar la presencia de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa.
Procedimientos
Método CTAB- mini preparaciones para extraer ADN
Se lavaron hojas jóvenes de eucalipto con abundante agua, luego se secaron con papel toalla, se seleccionaron los mejoresespecímenes y posteriormente se colocaron en un mortero previamente congelado, agregando nitrógeno líquido, macerando fuertemente hasta obtener un polvillo. Con ayuda de una cuchara se traslado el polvo al tubo clínico; adicionándole 1 µl de buffer de CTAB, y se paso a macerar con una microespátula, haciendo fuerza contra las paredes del tubo, se tapo y agito con el vortex.
Hasta uniformizar lasolución, dejándolo en baño de maría a 65 °C por 10 minutos, se dejo enfriar durante 5 minutos y se adiciono solución 24:1 de cloroformo-isoamyl alcohol haciéndolo llegar a 5 ml y se mezclo con el vortex.
Se micro centrífugo por un periodo de 10 minutos. Cuidadosamente se transfirió el sobrenadante a un tubo limpio y se repitió el microcentrifugado por 10 minutos. Posteriormente se transfirió elsobrenadante a un tubo limpio con la ayuda de una micro pipeta de 1 ml, se hizo llegar a los 4 ml del tubo con isopropanol y se mezclo ligeramente para que el ADN precipitara, así poder observar la formación de pequeñas hebras de ADN. Los tubos fueron almacenados en el freezer para su posterior análisis.
Visualización mediante electroforesis en gel de agarosa
Con la solución de agarosa(0.9%), mas el buffer (TBE) ya preparada, la bandeja se coloco en la cámara de electroforesis que contenía buffer TBE.
En papel parafina se colocaron 2 µl de azul de bromofenol, 9 µl de buffer de TE y 9 µl de ADN, posteriormente se coloco cada preparación de la solución que suman 20 µl del ADN coloreado, en los pozos del gel. Por 30 minutos se dejo migrar. Pasado los 30 minutos se saco el gel de...
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