Extraccion de ADN y Electroforesis en Geles de Agarosa

UNIVERSIDAD DE SUCRE
FACULTAD DE EDUCACIÓN Y CIENCIAS
PROGRAMA DE BIOLOGÍA
EXTRACIÓN DE ADN DE CELULAS SANGUINEAS Y VISUALIZACION DE ACIDOS NUCLEICOS POR ELECTROFORESIS
ELOISA AMELL AMELL, LUIS ORTEGA MACARENO, GENESY PEREZ JORGE


RESUMEN
La extracción de ADN a partir de células sanguíneas fue realizada mediante el uso aplicativo del método saltingout donde las proteínas y otroscontaminantes son precipitados de las células usadas usando altas concentraciones de sales tales como acetato de potasio o de amonio. Los precipitados son removidos luego por
Centrifugación, y el ADN es recuperado por precipitación con alcohol. Durante el proceso de extracción, solo se extrajo el ADN de todas las células sanguíneas (linfocitos, neutrófilos, basófilos y otros) excepto de los eritrocitosy las plaquetas, ya que estas son anucleadas y por ende no tienen ADN. Para visualizar el ADN estraido se utilizo la electroforesis en gel de agarosa para la identificación de moléculas ADN particulares por los patrones de banda.

INTRODUCCION
El DNA es la molécula esencial de todos los sistemas de organización biológica. La publicación del genoma humano ha abierto muchas puertas para lasinvestigaciones en el campo de la genética molecular, muchas de las técnicas empleadas en este creciente campo incluyen algún tipo de manipulación del material genético. Estos procedimientos han logrado adelantar hasta tal grado el conocimiento del código genético.
Los procedimientos iniciales eran largos y tediosos y podían pasar varios días antes de saber con certeza que se había logrado obtenerDNA en calidad y cantidad suficiente para poder manipularlo. Hoy día podemos obtener suficiente DNA de buena calidad en un tiempo mucho más reducido empleando los diferentes métodos existentes en la actualidad, los cuales, en sentido general tienen como punto de partida la destrucción y lisis de las células.
La concentración e integridad del ADN extraído, así como el tamaño de distintosfragmentos de ADN (por ejemplo, productos de PCR) pueden ser verificadas mediante electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. La electroforesis consiste en la separación de moléculas (proteínas, isoenzimas, ácidos nucléicos) a través de una matriz tamponada (agarosa, acrilamida, almidón). La matriz funciona como un filtro, separando las moléculas en un campo eléctrico, de acuerdo al tamaño y lacarga neta que poseen. En el caso de los ácidos nucléicos, el grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo (ánodo) durante la electroforesis (Posso y Ghneim 2008).
OBJETIVOS
Adquirir y habilidad en la manipulación y procesamiento de muestras sanguíneas para extraer ADN.
Visualizar medianteelectroforesis en gel de agarosa extractos de ADN y productos de PCR.
Adquirir destreza en la preparación de geles de agarosa y la siembra de muestras para realizar electroforesis.

MATERIALES Y METODOS
Para la extracción de ADN en una muestra de sangre, se utilizó el método de saltingout para el cual se necesitó una instrumentación y reactivos necesarios para el desarrollo de esta misma.
Teniendola muestra de sangre periférica, se transfirió un volumen de 500 µL a un microtubo de 1.5 ml y se centrifugo a 12.000 rpm por 5min a una temperatura de 4°C. Al precipitado obtenido se le agregaron 497.5 µL de un buffer de extracción o buffer de lisis, y se homogenizo; luego se le adicionaron 2.5 µL de proteinasa K, se incubo la muestra por 40 min a una temperatura de 55°C para y posteriormente seinactivo la enzima (proteínas K), en ebullición por 10 min.se centrifugo la muestra y se le adicionaron 500 µL de acetato de potasio 5M se mezcló por inversión y se incubo en hielo por espacio de 15 min. Se volvió a centrifugar y se le agrego al precipitado 0.6 volúmenes de isopropanol frio y se incubo la muestra en el freezer durante 15 min a una temperatura de -76°C. Se volvió a centrifugar,...