Extraccion De Adn

Extracción y análisis de ADN
Objetivo general: métodos de extracción y análisis de ADN.
Objetivos específicos:
2.1. Extraer ADN genómico de la bacteria Escherichia coli.(dia 1)
2.2. Extraer ADN plasmídico de la bacteria E. coli.(dia 1)
2.3. Estimar por espectrofotometría la concentración y pureza de las preparaciones de ADN ( día2) .
2.4. Analizar la calidad del ADN extraído mediante electroforesis en gel de agarosa ( día 2)
2.5. Realizar una digestión del ADN con enzimas de restricción ( día1) y analizar el patrón de restricción mediante
e lectroforesis ( día 2)
EXTRACCIÓN DE ADN
La extracción de ADN se realiza en tres etapas:
1) ruptura de las células y homogeneización de la muestra;
2) aislamiento del ADN de las proteínas y lípidos;
3) concentración del ADN.Homogeneización de la muestra
La forma de homogeneización depende de las características de la muestra. En general, se aplica una combinación
de agentes físicos y químicos que rompen tejidos.
Para tejidos blandos se emplean generalmente homogeneizadores que rompe n e l tejido en forma mecánica. Para
hacer más eficiente la lisis celular, se pueden inclu ir ciclos de agitación violenta (utilizando vortex)y/o combinar con
ciclos de congelado- descongelado de la muestra.
Para lisar células vegetales, hongos, bacterias, o cápsides virales, se suele congelar la muestra en nitrógeno líquido y
pulverizarla mientras permanece congelada con un mortero, evitando así la degradación de los AN por nucleasas
celulares
Dependiendo de la naturaleza de la muestra, en el “buffer” de lisis se puede n i ncluirenzimas que faciliten la
degradación de la pared celular (p.ej. lisozima, que hidroliza el peptidoglicano presente en la pared celular de las
bacterias)
La adición de detergentes permite l a desestabilización de la membrana celular alterando las interacciones
l ípido-lípido, lípido-proteína y proteína-proteína
Eliminación de proteínas
Pueden ser degradadas mediante el tratamiento conproteasas, como la proteinasa K. ( es activa en condiciones
relativamente exigentes como lo son la presencia de SDS, urea, agentes quelantes (EDTA),
Etc) . Por otro lado, un incremento de temperatura desde 37 a 50 - 65 ºC aumenta su actividad, en condiciones en
que las nucleasas que pueden afectar la integridad del ADN son inactivas. De este modo,
l a proteinasa K degrada las nucleasas y demásproteínas, y permite la obtención de ADN genómico de alto
peso molecular.
Otra forma de eliminar las proteínas y lípidos e s con solventes orgánicos que permite i nactivar y remover
compuestos solubles en la fase orgánica, y mediante una centrifugación posterior, eliminar proteínas
desnaturalizadas que precipitan e n la interfase (solv org.mezcla de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico ycloroformo:isoamílico La mezcla de solventes en la primera extracción ha ce que el procedimiento sea más e ficiente,
y l a segunda extracción remueve restos de fenol. Su principal desventaja radica en la toxicidad de los reactivos y en
e l descarte de los desechos orgánicos )
También se utilizan con frecuencia “kits” comerciales que permiten obtener AN de alta pureza: l a e xtracción del ADN
se basa en unacromatografía de intercambio iónico , en la que el ADN se une a una resina y después de realizar
varios l avados, el ADN es eluído en un pequeño volumen de agua o de buffer.
Concentración del ADN por precipitación
La precipitación de los AN permite eliminar contaminantes , cambiar el “buffer” en e l cual se encuentra disuelto y
concentrar el ADN .
Requiere la presencia de dos elementos: (i)cationes, provenientes de sales, que neutralizan la carga negativa
reduceniendo l a repulsión de las hebras de ADN y (ii) alcohol, que reduce la constante dieléctrica y deshidrata las
moléculas de ADN, haciendo que pierdan solubilidad y precipiten.

El Acetato de sodio e s la sal más frecuentemente e mpleada para precipitar ADN y ARN, mientras que el isopropanol
y e l etanol son los...