extraccion de ADN

5.1. FUNDAMENTO
La técnica de extracción de ácidos nucleicos en eucariotas, está relacionada con su ubicación en el núcleo celular y las propiedades físicas y químicas de todas las biomoléculas celulares.
Es preciso desorganizar la estructura de paredes y membranas para liberar los ácidos nucleicos.
Por mecanismos mecánicos y posteriormente químicos a través de la solución de lisis, se actúasobre las paredes y las  estructuras lipoproteicas de las membranas.
Se extraen de la mezcla de fragmentos celulares con alcoholes específicos, en los que los ácidos nucleicos no son solubles.
Una vez extraídos los ácidos nucleicos, se guardan en congelación.
5.2. MATERIAL
Equipamiento, materiales, reactivos, disoluciones
Es un método que no utiliza reactivos tóxicos
MATERIALES
Tubos deensayo
Vasos de precipitado
Probeta
Varilla de vidrio
Portaobjetos 
Cubreobjetos 
Embudo para filtrar
Mano de mortero
Tubos de ensayo para centrífuga
Pipetas Pasteur
Papel de filtro
Gradilla para tubos
Colador metálico 
Tijeras 
Pinzas
EQUIPOS
Balanza
Batidora de cocina
Baño termostático
Centrífuga 15.0000rpm
Cámara frigorífica
Nevera-congelador
Microscopio óptico 1000xREACTIVOS
Disolución de homogenización o solución salina al 0,9% de NaCl, mantener a 4ºC:
Agua desionizada 150mL 
NaCl 1,5g 
NaHCO3  bicarbonato de sódio 5g
Disolución de lisis o Buffer de lisis mantener a 4ºC: 
Agua desionizada 250mL 
NaCl  1,5g 
NaHCO3  bicarbonato de sódio 5g 
SDS dodecilsulfato sódico 5mL 
Proteinasa K 10mg/mL (zumo de piña)
Alcohol enfriado mantener a 0ºC
Isopropanol 80mL de o bien 
Etanol 70% 150mL de
Azul de metileno, colorante básico
5.3 PROCEDIMIENTO OPERATIVO
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA - HOMOGENIZACIÓN
El procedimiento se inicia homogenizando, disgregando y triturando la muestra mediante una licuadora o batidora con una solución de homogenización o solución salina enfriada a 4ºC.
La trituración mecánica produce la rotura de las células de los tejidos uórganos de la muestra escogida y la liberación del contenido celular, donde se encuentran los ácidos nucleicos.
FILTRACIÓN 
A continuación se realiza una filtración para separar y eliminar las estructuras celulares de mayor tamaño. 
La solución filtrada contiene los ácidos nucleicos, pero todavía confinados en los núcleos.

LISIS Y SEPARACIÓN
Se añade solución de lisis a 4ºC, que solubilizalas membranas nucleares y facilita la liberación de los ácidos nucleicos.
Esta solución de lisis contiene el detergente iónico dodecil sulfato de sodio, SDS, que dispersa las lipoproteínas de las membranas y desnaturaliza complejos proteínicos.
Las sales de la solución de lisis, neutralizan las cargas negativas que inician la precipitación de los ácidos nucleicos
La proteinasa K es una enzimaproteolítica que actúa sobre las proteínas. Nuestro método añade zumo de piña que contiene esta enzima.
Generalmente las soluciones de lisis contienen una sustancia que protege los ácidos nucleicos de la acción de las enzimas. Se trata de EDTA, sustancia inhibidora de la acción de las ADNasas. Nuestro método no incluye EDTA en la solución de lisis. 
Se centrifuga la muestra obtenida, así seconsigue separar una fase sólida, pellet (restos de células, proteínas, lípidos) de una fase acuosa, sobrenadante, que contiene ácidos nucleicos, hidrófilos y solubles en agua debido a sus grupos fosfato.
PRECIPITACIÓN 
Este sobrenadante se dosifica en un tubo de ensayo al que se añade isopropanol o etanol muy frío, produciendo la deshidratación y total precipitación de los ácidos nucleicosinsolubles en alcohol.
Los ácidos nucleicos se sitúan y visualizan en la interfase agua-alcohol.
RECUPERACIÓN Y ALMACENAMIENTO 
Se recuperan los ácidos nucleicos de la interfase y por centrifugación y posterior deshidratación se liberan del agua y del alcohol. 
La extracción se guarda hidratada a -20ºC
Observación al microscopio óptico
Se prepara una muestra al portaobjetos de los ácidos nucleicos...