Extraccion De Adn
Páginas: 9 (2066 palabras)
Publicado: 16 de diciembre de 2012
INTRODUCCIÓN.
La extracción del ADN es una técnica esencial en biología molecular. Esta técnica ha cobrado mucha importancia por la creciente demanda de análisis de ADN.
El propósito de la extracción del ADN es separar el material genético de todos los componentes celulares (agua, iones inorgánicos, aminoácidos, nucleótidos, lípidos, proteínas y RNA) para obtener una preparación homogéneade ADN, que represente toda la información genética contenida en la célula. Existen varios métodos para el aislamiento de ADN, en general todos ellos constan de cuatro pasos esenciales que son la ruptura celular, remoción de proteínas y ARN, concentración de ADN y determinación de la pureza y concentración del ADN (Surzycki, 1999).
Para una visualización del ADN entre las técnicas más destacablestenemos la electroforesis, una técnica analítica de separación de macromoléculas. La separación tiene lugar debido a la diferente movilidad que presentan las macromoléculas cargadas cuando son sometidas a la influencia de un campo eléctrico. Durante la electroforesis solo los iones positivos hidratados, normalmente asociados con los grupos aniónicos fijados de la agarosa, pueden moverse hacia elcátodo. El agua por lo tanto es empujada con estos iones positivos hacia el electrodo negativo y las moléculas negativas, como el ADN, migran hacia el electrodo positivo. El índice de migración del ADN a través de los geles de agarosa depende del tamaño de la molécula, concentración del gel, voltaje aplicado, conformación del ADN y buffer. Al ser excitado por luz UV fluoresce dando una tonalidadanaranjada en el lugar donde está presente la molécula.
Finalmente, para visualizar el ADN en los geles de agarosa se utiliza bromuro de etidio. El bromuro de etidio se une a los ácido nucleicos al intercalarse entre las bases nitrogenadas. El bromuro de etidio absorbe la radiación ultravioleta en una longitud de onda entre 302 y 366 nm y la remite como una fluorescencia de una longitud de ondade 590 nm. Mediante foto documentadora es posible ver el ADN en estos geles y almacenar digitalmente esta información.
OBJETIVOS.
* Obtener ADN de óptimo en calidad y cantidad para ser utilizado en técnicas de caracterización molecular.
* Caracterizarlos ácidos nucleicos usando electroforesis en gel de agarosa.
MARCO TEÓRICO.
La extracción y visualización del ADN es una técnicaesencial en biología molecular y consta de las siguientes etapas:
* RUPTURA CELULAR:La ruptura de la membrana celular es uno de los pasos más importantes en el aislamiento de ADN. Los procedimientos para romper las células son químicos, mecánicos y enzimáticos. Los métodos mecánicos incluyen a la sonicación, molienda, licuado o alta presión, sin embargo su aplicación puede causar lafragmentación del ADN. Los mejores procedimientos para abrir las células y obtener ADN intacto son a través de la aplicación de químicos (detergentes) y/o enzimas.
* REMOCIÓN DE PROTEÍNAS Y ARN:El segundo paso en la purificación es la remoción de proteínas y ARN del lisado celular. La remoción de proteínas de la solución de ADN depende de las diferencias físicas entre las propiedades de los ácidosnucleicos y proteínas. La remoción del ARN de las preparaciones de ADN se lleva a cabo usando procedimientos enzimáticos (RNasa).
* CONCENTRACIÓN DE ADN:Este paso de la purificación de ADN tiene dos propósitos. Primero concentrar el ADN de la solución de desproteinización y segundo remover las impurezas que permanecen en la solución producto de la lisis celular. Este paso puede ser implementadode dos maneras: precipitando el ADN con alcoholes o con diálisis al concentrar el ADN usando compuestos que absorban el agua.
* DETERMINACIÓN DE LA PUREZA Y CANTIDAD DE ADN:El último paso en cualquier procedimiento de aislamiento de ADN es la evaluación de los resultados, el cual se realiza al determinar la pureza y concentración del ADN. Este tipo de determinaciones se las puede realizar...
La extracción del ADN es una técnica esencial en biología molecular. Esta técnica ha cobrado mucha importancia por la creciente demanda de análisis de ADN.
El propósito de la extracción del ADN es separar el material genético de todos los componentes celulares (agua, iones inorgánicos, aminoácidos, nucleótidos, lípidos, proteínas y RNA) para obtener una preparación homogéneade ADN, que represente toda la información genética contenida en la célula. Existen varios métodos para el aislamiento de ADN, en general todos ellos constan de cuatro pasos esenciales que son la ruptura celular, remoción de proteínas y ARN, concentración de ADN y determinación de la pureza y concentración del ADN (Surzycki, 1999).
Para una visualización del ADN entre las técnicas más destacablestenemos la electroforesis, una técnica analítica de separación de macromoléculas. La separación tiene lugar debido a la diferente movilidad que presentan las macromoléculas cargadas cuando son sometidas a la influencia de un campo eléctrico. Durante la electroforesis solo los iones positivos hidratados, normalmente asociados con los grupos aniónicos fijados de la agarosa, pueden moverse hacia elcátodo. El agua por lo tanto es empujada con estos iones positivos hacia el electrodo negativo y las moléculas negativas, como el ADN, migran hacia el electrodo positivo. El índice de migración del ADN a través de los geles de agarosa depende del tamaño de la molécula, concentración del gel, voltaje aplicado, conformación del ADN y buffer. Al ser excitado por luz UV fluoresce dando una tonalidadanaranjada en el lugar donde está presente la molécula.
Finalmente, para visualizar el ADN en los geles de agarosa se utiliza bromuro de etidio. El bromuro de etidio se une a los ácido nucleicos al intercalarse entre las bases nitrogenadas. El bromuro de etidio absorbe la radiación ultravioleta en una longitud de onda entre 302 y 366 nm y la remite como una fluorescencia de una longitud de ondade 590 nm. Mediante foto documentadora es posible ver el ADN en estos geles y almacenar digitalmente esta información.
OBJETIVOS.
* Obtener ADN de óptimo en calidad y cantidad para ser utilizado en técnicas de caracterización molecular.
* Caracterizarlos ácidos nucleicos usando electroforesis en gel de agarosa.
MARCO TEÓRICO.
La extracción y visualización del ADN es una técnicaesencial en biología molecular y consta de las siguientes etapas:
* RUPTURA CELULAR:La ruptura de la membrana celular es uno de los pasos más importantes en el aislamiento de ADN. Los procedimientos para romper las células son químicos, mecánicos y enzimáticos. Los métodos mecánicos incluyen a la sonicación, molienda, licuado o alta presión, sin embargo su aplicación puede causar lafragmentación del ADN. Los mejores procedimientos para abrir las células y obtener ADN intacto son a través de la aplicación de químicos (detergentes) y/o enzimas.
* REMOCIÓN DE PROTEÍNAS Y ARN:El segundo paso en la purificación es la remoción de proteínas y ARN del lisado celular. La remoción de proteínas de la solución de ADN depende de las diferencias físicas entre las propiedades de los ácidosnucleicos y proteínas. La remoción del ARN de las preparaciones de ADN se lleva a cabo usando procedimientos enzimáticos (RNasa).
* CONCENTRACIÓN DE ADN:Este paso de la purificación de ADN tiene dos propósitos. Primero concentrar el ADN de la solución de desproteinización y segundo remover las impurezas que permanecen en la solución producto de la lisis celular. Este paso puede ser implementadode dos maneras: precipitando el ADN con alcoholes o con diálisis al concentrar el ADN usando compuestos que absorban el agua.
* DETERMINACIÓN DE LA PUREZA Y CANTIDAD DE ADN:El último paso en cualquier procedimiento de aislamiento de ADN es la evaluación de los resultados, el cual se realiza al determinar la pureza y concentración del ADN. Este tipo de determinaciones se las puede realizar...
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