Extraccion De DNA Plasmidico Y Verificacion De Pureza
Páginas: 8 (1821 palabras)
Publicado: 26 de junio de 2015
Extracción de DNA plasmidico y verificación de pureza
Resumen
Para la extracción del DNA plasmidico se utilizó la técnica de miniprep a partir de 3 muestras distintas (3 grupos trabajaron sin RNAsa y 2 con). Por medio de las técnicas de verificación de pureza realizados (Absorbancia 260/280 y electroforesis en gel de agarosa) se pudo observar que no había contaminación de proteínas, que elplásmido se encontraba en sus 3 conformaciones (no para todos los grupos) y había contaminación de DNA cromosómico en todos los grupos y solo había RNA en los grupos que no actuaron con RNAsa.
Introducción
Plásmidos
Los plásmidos son moléculas de DNA circular pequeñas (alrededor de 3kb) que se desarrollan de forma natural en muchas bacterias y eucariontes unicelulares. En muchos casos transportangenes que codifican resistencia a antibióticos. Por esto mismo los plásmidos son los vectores de clonación mas comunes. Estos son extracromosomales y pueden propagarse en forma independiente en el hospedador y son portadores de un tipo de marcador seleccionable. En algunos casos los plásmidos tienen sitios de restricción exclusivos, lo que los hace bastante útiles. Los plásmidos se puedenencontrar en 3 conformaciones distintas y se pueden observar en distintas bandas de un gel de agarosa:
Plásmido lineal, este se observara en el gel de agarosa dependiendo su peso molecular.
Plásmido relajado, este se observara sobre el plásmido lineal.
Plásmido superenrrolado, este se observara por debajo del plásmido lineal.
Enzimas de restricción
Las enzimas de restricción son un tipo deendonucleasas (enzimas que realizan cortes en medio de una cadena de DNA) que actúan sobre una secuencia especifica de bases que por lo general van de 4 a 8. Esta secuencia de corte esta dado por la enzima de restricción (hay muchísimas de estas y todas actúan en una secuencia única).
Miniprep
La miniprep es una técnica para extracciones de plásmidos a partir de un pequeño volumen (1-1,5 ml) de cultivobacteriano saturado. En líneas generales, cuanto más chico sea el plásmido, mejor es el resultado obtenido, ya que a medida que se incrementa el tamaño, sus propiedades se asemejan cada vez más a las del DNA cromosómico. Con plásmidos mayores a 25 kb el aislamiento se hace dificultoso y el rendimiento es muy bajo. Sin embargo para los vectores de uso rutinario el rendimiento es muy bueno y elproducto obtenido es lo suficientemente puro como para realizar digestiones con endonucleasas de restricción sin necesidad de una purificación ulterior.
Contaminación por espectrofotometría
La técnica de espectrofotometría se puede utilizar para determinar si una muestra de ácidos nucleicos contiene contaminación con proteínas, esto se realiza haciendo una relación entre la absorbancia a 260 y una a280, esto se debe a que solo los ácidos nucleicos actúan a 260, en cambio a 280 es el punto máximo de absorbancia de las proteínas pero también actúan a menor medida ácidos nucleicos. Por esta razón haciendo una relación 260/280 se puede determinar la pureza de la muestra. Si el valor resultante es menor a 1.60, entonces se considera que la muestra está contaminada con proteínas, y si el valores mayor a 2 se puede decir que hay una presencia grande de ácidos nucleicos en la muestra.
Electroforesis en gel de agarosa
El fenómeno denominado electroforesis sucede cuando una molécula con una carga neta en solución se desplaza por acción de una campo eléctrico; de esta manera la molécula migra hacia uno u otro electrodo según su carga neta, por lo tanto los aniones migrarán hacia elcátodo (+) y los cationes hacia el ánodo (-). En estas condiciones las moléculas disueltas migran a una velocidad proporcional a la relación carga: masa. Por lo tanto la velocidad de migración a través del campo eléctrico dependerá: carga neta, tamaño y conformación de la molécula; fuerza del campo eléctrico, fuerza iónica, viscosidad y temperatura del medio. Donde:
v: velocidad de migración de la...
Resumen
Para la extracción del DNA plasmidico se utilizó la técnica de miniprep a partir de 3 muestras distintas (3 grupos trabajaron sin RNAsa y 2 con). Por medio de las técnicas de verificación de pureza realizados (Absorbancia 260/280 y electroforesis en gel de agarosa) se pudo observar que no había contaminación de proteínas, que elplásmido se encontraba en sus 3 conformaciones (no para todos los grupos) y había contaminación de DNA cromosómico en todos los grupos y solo había RNA en los grupos que no actuaron con RNAsa.
Introducción
Plásmidos
Los plásmidos son moléculas de DNA circular pequeñas (alrededor de 3kb) que se desarrollan de forma natural en muchas bacterias y eucariontes unicelulares. En muchos casos transportangenes que codifican resistencia a antibióticos. Por esto mismo los plásmidos son los vectores de clonación mas comunes. Estos son extracromosomales y pueden propagarse en forma independiente en el hospedador y son portadores de un tipo de marcador seleccionable. En algunos casos los plásmidos tienen sitios de restricción exclusivos, lo que los hace bastante útiles. Los plásmidos se puedenencontrar en 3 conformaciones distintas y se pueden observar en distintas bandas de un gel de agarosa:
Plásmido lineal, este se observara en el gel de agarosa dependiendo su peso molecular.
Plásmido relajado, este se observara sobre el plásmido lineal.
Plásmido superenrrolado, este se observara por debajo del plásmido lineal.
Enzimas de restricción
Las enzimas de restricción son un tipo deendonucleasas (enzimas que realizan cortes en medio de una cadena de DNA) que actúan sobre una secuencia especifica de bases que por lo general van de 4 a 8. Esta secuencia de corte esta dado por la enzima de restricción (hay muchísimas de estas y todas actúan en una secuencia única).
Miniprep
La miniprep es una técnica para extracciones de plásmidos a partir de un pequeño volumen (1-1,5 ml) de cultivobacteriano saturado. En líneas generales, cuanto más chico sea el plásmido, mejor es el resultado obtenido, ya que a medida que se incrementa el tamaño, sus propiedades se asemejan cada vez más a las del DNA cromosómico. Con plásmidos mayores a 25 kb el aislamiento se hace dificultoso y el rendimiento es muy bajo. Sin embargo para los vectores de uso rutinario el rendimiento es muy bueno y elproducto obtenido es lo suficientemente puro como para realizar digestiones con endonucleasas de restricción sin necesidad de una purificación ulterior.
Contaminación por espectrofotometría
La técnica de espectrofotometría se puede utilizar para determinar si una muestra de ácidos nucleicos contiene contaminación con proteínas, esto se realiza haciendo una relación entre la absorbancia a 260 y una a280, esto se debe a que solo los ácidos nucleicos actúan a 260, en cambio a 280 es el punto máximo de absorbancia de las proteínas pero también actúan a menor medida ácidos nucleicos. Por esta razón haciendo una relación 260/280 se puede determinar la pureza de la muestra. Si el valor resultante es menor a 1.60, entonces se considera que la muestra está contaminada con proteínas, y si el valores mayor a 2 se puede decir que hay una presencia grande de ácidos nucleicos en la muestra.
Electroforesis en gel de agarosa
El fenómeno denominado electroforesis sucede cuando una molécula con una carga neta en solución se desplaza por acción de una campo eléctrico; de esta manera la molécula migra hacia uno u otro electrodo según su carga neta, por lo tanto los aniones migrarán hacia elcátodo (+) y los cationes hacia el ánodo (-). En estas condiciones las moléculas disueltas migran a una velocidad proporcional a la relación carga: masa. Por lo tanto la velocidad de migración a través del campo eléctrico dependerá: carga neta, tamaño y conformación de la molécula; fuerza del campo eléctrico, fuerza iónica, viscosidad y temperatura del medio. Donde:
v: velocidad de migración de la...
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