Extraccion de dna

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE GUERRERO
UNIDAD ACADÉMICA
CIENCIAS QUIMICO BIOLOGICAS

CURSO DE BIOLOGIA MOLECULAR
PRACTICA No. 2

OBTENCION Y PURIFICACION DE DNA CROMOSOMAL

OBJETIVO

Extraer ypurificar DNA cromosomal de raspado de la mucosa oral.

MATERIAL Y REACTIVOS

Baño metabólico
Microcentrífuga
Agitador Vortex
Micropipetas de volumen variable (20, 200 y 1000 µl).
TubosEppendorf
Puntas para micropipeta
Gradilla para tubos Eppendorf
Guantes de látex
Solución de extracción: Tris 10 mM pH 8.0, EDTA 20 mM pH 8.0, SDS 0.5%.
Proteinasa K (20 mg/ml)
Fenol/Cloroformoamortiguado a pH 8.0
Cloroformo-alcohol isoamílico (24:1)
LiCl 8 M
NaCl 5 M
Isopropanol
Etanol al 70%
H2O desionizada estéril

PROCEDIMIENTO

1. Colectar la muestra de células en 750 µl de lasolución de extracción (Tris 10 mM pH 8.0, EDTA 20 mM pH 8.0, SDS 0.5%) contenida un un tubo Eppendorf.
2. Agregar 3.8 µl de la solución de proteinasa K de 20 mg/ml (concentración final de 100 µg/ µl).3. Incubar 20 minutos a 65°C.
4. Extraer con fenol/cloroformo y cloroformo-isoamílico después de la incubación con la proteinasa K. Para ello se adicionan 200 µl de fenol/cloroformo amortiguado a pH8.0, se agita vigorosamente utilizando un agitador Vortex durante 40 seg.
5. Centrifugar a 13,000 rpm en la microcentrífuga durante 4 min a 4°C.
6. Separar la fase acuosa cuidando de no llevar lainterfase blanca que contiene proteínas.
7. Repetir el procedimiento anterior (4-6) con cloroformo-isoamílico.
8. Agregar 75 µl de LiCl 8M (conc. final 0.8 M), agitar unos segundos en agitador Vortex,y centrifugar por 5 min a 13,000 rpm en la microcentrífuga a 4°C.
9. Recuperar el sobrenadante, agregar 40 µl de NaCl 5M (conc. final 0.2 M), agitar unos segundos con agitador Vortex, agregar 1volumen de isopropanol (850 µl) y agitar lentamente por inversión hasta que se forme la hebra de DNA.
10. Recuperar la hebra de DNA con una punta de plástico y pasarla a otro tubo o centrifugar para...