extraccion de DNA
Páginas: 11 (2529 palabras)
Publicado: 24 de abril de 2014
UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICAS
CARRERA DE BIOQUÍMICA
CÁTEDRA DE BIOLOGÍA MOLECULAR
PRÁCTICA Nº 2
EXTRACCIÓN DE DNA CROMOSOMAL DE CÉLULAS EUCARIOTAS
Día de práctica: Jueves Grupo: ALFA 2 Fecha: 03-Abril-14
I. OBJETIVOS
A . Objetivo General
Realizar la extracción de DNA cromosomal de los leucocitos presentes, enuna muestra de sangre venosa.
B. Objetivos específicos
Realizar todos los cálculos necesarios para la modificación de las concentraciones o volúmenes de los reactivos que utilizaremos en la práctica.
Realizar el proceso de extracción de DNA con sumo cuidado para no contaminar la muestra, en cada una de sus etapas de extracción, para evitar que los contaminantes activen a las nucleasasque desnaturalizarían al DNA cromosomal.
Aislar DNA cromosomal provenientes de los leucocitos.
II. METODOLOGÍA
1. Se extrajo 3ml de sangre de un compañero de laboratorio en un tubo y se introdujo 32,2ul de EDTA para no ocurra la coagulación.
2. Llevamos a la centrifuga durante 2500 rpm a temperatura ambiente, durante 3minutos, para una mejor separación del plasma y los elementosformes.
3. Se aspiró el plasma hasta 5ml encima del tapón leucoplaquetario.
4. Añadimos solución A(compuesta de sucrosa; tris; ClMg2; y triton 100X) hasta un volumen de 8ml, mezclar por inversión. En hielo durante 30 minutos para evitar la desnaturalización.
5. Centrifugamos 2500rpm durante minutos, y aspirar 7ml del sobre nadante y se lo descarto.
6. Se añadió solución Anuevamente asta aforar 8ml. Mezclar con delicadeza y dejar en hielo durante 20 minutos.
7. Nuevamente se centrifuga a 2500rpm durante 3minutos y descartar el sobre nadante por inversión, escurriendo todo el líquido con ayuda de papel filtro esta evitara que se pierda residuos que contengan material genético.
8. Insertar 0,5 ml de solución B(compuesta de TRIS =7, 5; NaCl; SDS)esta solucióntiene como principal función evitar cambios bruscos de PH, mantener la integridad del ADN y manteniendo la presión osmótica en su normalidad , 20 ul de SDS al 20% (solubilizante de proteínas )y 80ul de proteinasa K(2mg/ml), se deja a refrigeración toda la noche a 37ºC
9. Al día siguiente, a la muestra se añadió 150ul de NaCl 6 M solución incolora produce la precipitación de DNA y se mezclódurante 5 minutos, se centrifugo un vez más 2500rpm durante 3 minutos.
10. Separamos el sobre nadante del sedimento y lo incorporamos a otro tubo.
11. Añadimos dos veces el volumen de etanol absoluto lentamente por las paredes del tubo y se observación de aglomerados DNA.
12. Extrajimos el aglomerado de DNA con una pipeta Pasteur y se deposita en un tubo Eppendorf que contiene400ul de tampón TE. evitando los cambios bruscos de pH y previniendo la desnaturalización de DNA ya presente.
13. Se agregó al tubo Eppendorf con ADN 200 ul de alcohol absoluto, y mezcla con delicadeza por inversión 10 veces, luego lo llevamos a hielo durante 5minutos.
14. Centrifugamos durante 10 minutos en una microcentrifuga a 12.000 rpm, y se desechó el alcohol por inversión y se agregó500ul de alcohol 70%, se refrigera a 4ºC para posteriormente llevar a electroforesis y determinar si se extrajo DNA cromosomal de la muestra.
Equipos utilizados.
A. Centrifugadora.
Modelo: Fisher
Capacidad: 12 tubos
Forma de funcionamiento: este equipo pone en rotación una muestra para acelerar la sedimentación de sus componentes, según su densidad.Figura Nro. 2. Centrifugadora
B. Microcentrifuga
Modelo: Sigma
Capacidad: 14 tubos
Forma de funcionamiento: este equipo pone en rotación una muestra pequeña para separar por fuerza de rotación sus componentes, en función a su densidad.
Figura Nro. 3. Microcentrifugadora
C. Micropípeta.
Modelo: Eppendorf
III. RESULTADOS.
En la placa de electroforesis se...
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICAS
CARRERA DE BIOQUÍMICA
CÁTEDRA DE BIOLOGÍA MOLECULAR
PRÁCTICA Nº 2
EXTRACCIÓN DE DNA CROMOSOMAL DE CÉLULAS EUCARIOTAS
Día de práctica: Jueves Grupo: ALFA 2 Fecha: 03-Abril-14
I. OBJETIVOS
A . Objetivo General
Realizar la extracción de DNA cromosomal de los leucocitos presentes, enuna muestra de sangre venosa.
B. Objetivos específicos
Realizar todos los cálculos necesarios para la modificación de las concentraciones o volúmenes de los reactivos que utilizaremos en la práctica.
Realizar el proceso de extracción de DNA con sumo cuidado para no contaminar la muestra, en cada una de sus etapas de extracción, para evitar que los contaminantes activen a las nucleasasque desnaturalizarían al DNA cromosomal.
Aislar DNA cromosomal provenientes de los leucocitos.
II. METODOLOGÍA
1. Se extrajo 3ml de sangre de un compañero de laboratorio en un tubo y se introdujo 32,2ul de EDTA para no ocurra la coagulación.
2. Llevamos a la centrifuga durante 2500 rpm a temperatura ambiente, durante 3minutos, para una mejor separación del plasma y los elementosformes.
3. Se aspiró el plasma hasta 5ml encima del tapón leucoplaquetario.
4. Añadimos solución A(compuesta de sucrosa; tris; ClMg2; y triton 100X) hasta un volumen de 8ml, mezclar por inversión. En hielo durante 30 minutos para evitar la desnaturalización.
5. Centrifugamos 2500rpm durante minutos, y aspirar 7ml del sobre nadante y se lo descarto.
6. Se añadió solución Anuevamente asta aforar 8ml. Mezclar con delicadeza y dejar en hielo durante 20 minutos.
7. Nuevamente se centrifuga a 2500rpm durante 3minutos y descartar el sobre nadante por inversión, escurriendo todo el líquido con ayuda de papel filtro esta evitara que se pierda residuos que contengan material genético.
8. Insertar 0,5 ml de solución B(compuesta de TRIS =7, 5; NaCl; SDS)esta solucióntiene como principal función evitar cambios bruscos de PH, mantener la integridad del ADN y manteniendo la presión osmótica en su normalidad , 20 ul de SDS al 20% (solubilizante de proteínas )y 80ul de proteinasa K(2mg/ml), se deja a refrigeración toda la noche a 37ºC
9. Al día siguiente, a la muestra se añadió 150ul de NaCl 6 M solución incolora produce la precipitación de DNA y se mezclódurante 5 minutos, se centrifugo un vez más 2500rpm durante 3 minutos.
10. Separamos el sobre nadante del sedimento y lo incorporamos a otro tubo.
11. Añadimos dos veces el volumen de etanol absoluto lentamente por las paredes del tubo y se observación de aglomerados DNA.
12. Extrajimos el aglomerado de DNA con una pipeta Pasteur y se deposita en un tubo Eppendorf que contiene400ul de tampón TE. evitando los cambios bruscos de pH y previniendo la desnaturalización de DNA ya presente.
13. Se agregó al tubo Eppendorf con ADN 200 ul de alcohol absoluto, y mezcla con delicadeza por inversión 10 veces, luego lo llevamos a hielo durante 5minutos.
14. Centrifugamos durante 10 minutos en una microcentrifuga a 12.000 rpm, y se desechó el alcohol por inversión y se agregó500ul de alcohol 70%, se refrigera a 4ºC para posteriormente llevar a electroforesis y determinar si se extrajo DNA cromosomal de la muestra.
Equipos utilizados.
A. Centrifugadora.
Modelo: Fisher
Capacidad: 12 tubos
Forma de funcionamiento: este equipo pone en rotación una muestra para acelerar la sedimentación de sus componentes, según su densidad.Figura Nro. 2. Centrifugadora
B. Microcentrifuga
Modelo: Sigma
Capacidad: 14 tubos
Forma de funcionamiento: este equipo pone en rotación una muestra pequeña para separar por fuerza de rotación sus componentes, en función a su densidad.
Figura Nro. 3. Microcentrifugadora
C. Micropípeta.
Modelo: Eppendorf
III. RESULTADOS.
En la placa de electroforesis se...
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