Extraccion de DNa

Juan G. Gastón
Procedimiento
Extracción de proteínas solubles
-Añadimos 2 ml del cultivo líquido de levaduras.
-Centrifugamos por 3 minutos a máxima velocidad.
-Descartamos elsobrenadanten (contiene mayormente medio de cultivo)
-Repetimos los primeros tres pasos
- Añadimos 100µl de la solución 0.2M de NaOH
-Incubar 5 minutos a temperatura ambiente
-Centrifugamos a máxima velocidadpor 5 minutos.
-Resuspendimos el pellet en 50µl de SDS sample buffer.
-Hervimos la muestra durante 3 minutos.
- Centrifugamos nuevamente por 5 minutos.
-Recolectamos el sobrenadante para laelectroforesis de Poliacrilamida.
-Guardamos la muestra hasta el próximo laboratorio.

Procedimiento de la cuantificación de proteínas solubles
Con este proceso se pretende determinar la concetraciónde proteínas del extracto de la
levadura ..... Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de
estos métodos se basan en la propiedad intrínseca de las proteínas paraabsorber luz en el UV, para la formación de derivados químicos o la
capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes.

Método de Bradford:
Se basa en la unión de un colorante,Comassie Blue G-250 (también
Serva Blue) a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos
formas una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para
formar un complejoproteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor
que el colorante libre. Este método es sensible (1-15 µg), simple, rápido, barato
y pocas sustancias interfieren en su determinación. Entrelas sustancias que
interfieren están los detergentes y las soluciones básicas.

Preparación del reactivo Bradford:
Se mezcla 10mg de Comassie Blue G-250 con 10ml de fosfórico al 88 % 4,7 ml deetanol
absoluto y luego se añade 100ml de H2O.
Se filtra a través de un papel filtro y se guarda en la oscuridad.

Solución estándar (albúmina)
Se disuelve 10mg de albúmina bovina en 10ml de...