Extraccion de proteinas

TALLER 3. EXTRACCIÓN DE PROTEINAS
Preguntas teóricas
1. Proceso para la extracción de proteínas: Precipitación salina o salado con Sulfato de Amonio

a) El primer paso a seguir para un proceso de extracción de proteínas es la lisis o rotura celular, en la cual, se ‘destruyen’ los bordes celulares (membrana plasmática y/o pared celular según el caso) para así permitir la liberación de lasproteínas de interés, sin ninguna modificación molecular, evitando efectos secundarios por degradación térmica o proteólisis, entre otros (Universidad Nacional de Quilmes, 2009). Para lo anterior, y según las características del tejido u organismo de estudio existen varias técnicas como
Lisis celular: consiste en suspender las células en una solución hipotónica para inducir la entrada de agua aellas (presión osmótica) causando su hinchamiento y rotura. Este procedimiento es válido para células sin pared celular (Universidad Nacional de Quilmes, 2009).
Homogenización: es un proceso de destrucción mecánica, el cual puede inducirse por medio de una licuadora o un homogenizador, que generan un cambio brusco de presión y como consecuencia se ‘rompe’ la célula (ITESCAM, 2010).
Ciclos decongelación: la rotura se da por cambios bruscos de temperatura a los que se somete la muestra celular (ITESCAM, 2010).
b) Luego de la lisis, se procede a la separación de los diferentes componentes celulares, esto se puede llevar a cabo por medio de centrifugación diferencial (10 000-15 000 rpm). En este apartado, las proteínas de membrana quedarán en el fondo del centrifugado y en el sobrenadante,quedarán otras proteínas solubles; estas últimas serán las proteínas de interés (ITESCAM, 2010).
c) Una vez separado el sobrenadante, este se someterá a la técnica de precipitación con Sulfato de amonio. Esta sal es muy soluble en agua a temperatura ambiente (760g/1L a 20°C) y es adecuada para generar la precipitación proteica, ya que el ión sulfato divalente permite alcanzar altas fuerzas iónicasen el medio (Espinel, n.d.). Es importante resaltar, que entre los factores que alteran la solubilidad de las proteínas se encuentran la temperatura, el pH del medio y la fuerza iónica. Esta última, es el fundamento de este proceso de extracción; en general, las proteínas requieren de un medio salino para entrar en solución (fenómeno de “salting-in”) y pueden ser precipitadas a altasconcentraciones de sal (“salting-out”) (Espinel, n.d.).
Las proteínas en solución, interactúan con el agua a través de puentes de hidrógeno, debido a la presencia de grupos polares en sus aminoácidos. De esta manera, cuando se adicionan altas concentraciones de iones muy cargados, estos aumentan la fuerza iónica del medio y disminuyen las interacciones de las proteínas con el agua, ya que se disminuye enmedio de solvatación (menos moléculas de H2O disponibles para la interacción). Por lo anterior, las interacciones proteína-proteína son predominantes ante las interacciones agua-proteína y es así como ocurre la precipitación (IIB (Instituto de Investigación Biológica Argentino), 2011).

2. Estudio molecular de proteínas

El premio nobel de química en el 2002, Kurt Wüthrich, desarrolló una técnicade resonancia magnética nuclear (RMN) (la misma que se utiliza en medicina) (La Nación, 2002), con el objetivo de tomar imágenes de proteínas tridimensionales en solución. Esta técnica, permite investigar la molécula en su posición original, por esto, contribuye a identificar la ubicación en el espacio de todos los átomos que la componen, además de su movilidad (SDH , 2000). Esta técnica sefundamenta en un fenómeno físico-cuántico donde se aprovecha el momento angular y magnético de cada núcleo presente en los átomos que componen la proteína.
Este científico, junto con otros, desarrolló algunos métodos precisos para identificar las proteínas más importantes dentro de una célula. Para esto, implementaron la técnica de electroforesis en donde se separan las moléculas por su movilidad en...