Extraccion De Rna

Universidad de Puerto Rico
Recinto de Río Piedras
Departamento de Biología
Laboratorio Biología Molecular Celular (BIOL 4036)

Extracción de RNA total
Introducción
El ácido ribonucleico (RNA), es un polímero lineal de nucleótidos que forman una larga
cadena. Esta cadena se extiende por enlaces fosfodiestéricos que van de 5’a 3’ alternando los
azúcares ribosa. El RNA tiene cuatroestructuras principales rRNA, tRNA, mRNA y snRNA.
Una célula mamífera contiene alrededor de 80-85% rRNA, el restante consiste en las otras
estructuras especies de bajo peso molecular.
La estructura de RNA difiere en varias características a la estructura del ácido ribonucleico
(DNA). El RNA contiene una ribosa que se caracteriza por un grupo OH en la segunda posición
de la molécula (2’) al igual queen la tercera posición molecular (3’). Esta es una de sus
características distintivas al DNA que solo contiene un grupo OH en la tercera posición y la hace
susceptible a degradación e hidrolisis. Otra de sus características únicas es que una de sus bases
nitrogenadas es uracil que se parea con adenina en vez de timina en el caso de DNA.
Como los RNAs tienen pesos moleculares definidos sepueden dividir por electroforesis
de gel, centrifugación por densidad de gradiente, intercambio de aniones o cromatografía liquida.
En el caso de mRNA es heterogéneo en tamaño y secuencia, pero al tener un terminal 3’ es
posible purificarlo a través de una cromatografía de afinidad en oligo(dT)-celulosa.
La extracción de RNA es un proceso muy delicado, por lo tanto es un factor crítico
mantener unárea de trabajo limpio. El RNA es susceptible a digestión por enzimas llamadas
ribonucleasas que se encuentran prácticamente en todos lados. Las ribonucleasas son sumamente
difíciles de inactivar y resistentes.
Este ejercicio de laboratorio se compone de tres partes: calcular la densidad celular,
extracción de RNA y la cuantificación de la muestra de RNA.

Densidad celular
Esta primeraparte del laboratorio consiste en calcular la densidad de las células
utilizando un hemacitometro.
Nota: Para más información busque protocolo de Cultivo Celular

Es importante que la densidad del cultivo no sea mayor de 1.0 x10^7 células /mL, ya que se
sobrepasaría la capacidad de enlace de la columna de RNA y no obtendría una extracción
eficiente.
Extracción RNA
Ya que la molécula de RNAes extremadamente susceptible a degradación, el proceso de
extracción deberá ser realizado de forma rápida y eficiente. Hay dos pasos cruciales en la
extracción de RNA, la disrupción y la homogenización de las células o tejidos. La disrupción es
el proceso por el cual las membranas plasmáticas en la célula y los organelos permiten la
liberación del RNA. El rompimiento se lleva a cabo con elBuffer RLT Plus. La homogenización
es un proceso necesario para reducir la viscosidad del lisado producido por la disrupción. El no
homogenizar de la forma correcta resulta en un enlace ineficiente del RNA a la columna.
El DNA es eliminado utilizando una de las columnas de purificación la cual está
compuesta de silica, ya que el DNA se enlaza a la silica en presencia de ciertas sales. Lacontaminación de DNA también se disminuye al utilizar la densidad adecuada de células.
La solución que queda contiene el RNA. Se añade etanol 70% el cual crea las
condiciones óptimas para enlace de RNA por la columna. Luego se lava repetidamente la
solución con los buffers RPE y RW1. Estos buffers contienen sales de guanidina que ayudan a
inactivar ribonucleasas. Finalmente se diluye el RNA en agualibre de ribonucleasas y se obtiene
el RNA total.

Verificación de RNA
Luego de haber llevado a cabo una extracción de RNA es sumamente importante
verificar la eficiencia de la extracción. La misma se llevara a cabo de dos maneras, primero
utilizando un análisis espectrofotométrico y luego a través de una electroforesis (ya sea
denaturante o nativa).
A. Extracción y purificación de RNA...